Metodo di microscopia a contrasto di fase

La maggior parte delle strutture cellulari differisce poco nell'indice di rifrazione della luce, nell'assorbimento dei raggi l'una dall'altra e dall'ambiente. Per studiare tali componenti, è necessario modificare l'illuminazione (con perdita di nitidezza dell'immagine) o utilizzare metodi e dispositivi speciali. La microscopia a contrasto di fase è uno di questi metodi. È ampiamente utilizzato nello studio vitale delle cellule. L'essenza del metodo è che anche con differenze molto piccole negli indici di rifrazione dei diversi elementi del farmaco, l'onda luminosa che li attraversa subisce diversi cambiamenti di fase. Invisibili direttamente né all'occhio né alla lastra fotografica, questi cambiamenti di fase vengono convertiti da uno speciale dispositivo ottico in cambiamenti nell'ampiezza dell'onda luminosa, cioè in cambiamenti di luminosità già visibili all'occhio o registrati sullo strato fotosensibile. Nell'immagine visibile risultante, la distribuzione della luminosità (ampiezze) riproduce il rilievo di fase. L'immagine risultante è chiamata contrasto di fase. Gli oggetti possono apparire scuri su uno sfondo chiaro (contrasto di fase positivo) o chiari su uno sfondo scuro (contrasto di fase negativo).

Metodo di contrasto di interferenza (microscopia di interferenza)

Il metodo del contrasto di interferenza è simile al precedente: entrambi si basano sull'interferenza dei raggi che sono passati attraverso la microparticella e l'hanno superata. Un raggio di raggi di luce paralleli dall'illuminatore si divide in due flussi, entrando nel microscopio. Uno dei raggi ottenuti è diretto attraverso la particella osservata e acquisisce cambiamenti nella fase di oscillazione, l'altro - aggirando l'oggetto lungo lo stesso ramo ottico o aggiuntivo del microscopio. Nella parte oculare del microscopio, entrambi i raggi si ricollegano e interferiscono l'uno con l'altro. Come risultato dell'interferenza, verrà costruita un'immagine su cui sezioni della cella con spessori diversi o densità diverse differiranno l'una dall'altra in termini di contrasto. Il metodo del contrasto di interferenza viene spesso utilizzato in combinazione con altri metodi di microscopia, in particolare l'osservazione in luce polarizzata. Il suo utilizzo in combinazione con la microscopia ultravioletta consente, ad esempio, di determinare il contenuto di acidi nucleici nella massa secca totale di un oggetto.

Microscopia polarizzante

La microscopia polarizzante è un metodo di osservazione in oggetti a luce polarizzata che hanno isotropia, cioè orientamento ordinato delle particelle submicroscopiche. Un polarizzatore è posto davanti al condensatore di un microscopio polarizzatore, che trasmette onde luminose con un certo piano di polarizzazione. Dopo la preparazione e la lente, viene posizionato un analizzatore in grado di trasmettere la luce con lo stesso piano di polarizzazione. Se poi l'analizzatore viene ruotato di 90° rispetto al primo, non passerà luce. Nel caso in cui tra tali prismi incrociati ci sia un oggetto che ha la capacità di polarizzare la luce, sarà visto brillare in un campo oscuro. Utilizzando un microscopio polarizzatore, si può verificare, ad esempio, la disposizione orientata delle micelle nella parete cellulare della pianta.

Microscopia polarizzante

La microscopia polarizzante consente di studiare oggetti di studio in luce formata da due fasci polarizzati in piani reciprocamente perpendicolari, cioè in luce polarizzata. A tale scopo vengono utilizzate polaroid filmose o prismi di Nicol, che vengono posizionati in un microscopio tra la sorgente luminosa e la preparazione. La polarizzazione cambia quando i raggi di luce attraversano vari componenti strutturali di cellule e tessuti, le cui proprietà sono disomogenee, o quando vengono riflessi da essi.

Nelle strutture otticamente isotrope, la velocità di propagazione della luce polarizzata non dipende dal piano di polarizzazione; nelle strutture anisotropiche, varia a seconda della direzione della luce lungo l'asse longitudinale o trasversale dell'oggetto. Se l'indice di rifrazione della luce lungo la struttura è maggiore che nella direzione trasversale, si verifica birifrangenza positiva, con relazioni inverse - birifrangenza negativa. Molti oggetti biologici hanno un orientamento molecolare rigoroso, sono anisotropi e causano birifrangenza luminosa positiva.

Microscopia in campo oscuro

Durante la microscopia con il metodo del campo oscuro, la preparazione viene illuminata lateralmente con fasci obliqui di raggi che non cadono nell'obiettivo. Solo i raggi entrano nella lente, che vengono deviati dalle particelle di droga a causa di riflessione, rifrazione o diffrazione. Per questo motivo, le cellule microbiche e altre particelle sembrano brillare intensamente su uno sfondo nero (l'immagine ricorda un cielo stellato scintillante).

Per la microscopia in campo oscuro vengono utilizzati un condensatore speciale (condensatore paraboloide o condensatore cardioide) e obiettivi convenzionali. Poiché l'apertura dell'obiettivo ad immersione è maggiore dell'apertura del condensatore di campo oscuro, all'interno dell'obiettivo ad immersione viene inserito uno speciale diaframma tubolare per ridurne l'apertura.

L'esame istologico è l'esame dei tessuti al microscopio. Uno studio citologico differisce da uno istologico in quanto non esamina il tessuto, ma lo studio delle cellule.

Tipi di microscopia

Metodi di microscopia ottica
Metodi di microscopia ottica (illuminazione e osservazione). I metodi di microscopia vengono scelti (e forniti in modo costruttivo) a seconda della natura e delle proprietà degli oggetti studiati, poiché questi ultimi, come notato sopra, influenzano il contrasto dell'immagine.

Metodo del campo chiaro e sue varietà
Il metodo del campo chiaro in luce trasmessa viene utilizzato nello studio di preparazioni trasparenti con particelle assorbenti (che assorbono la luce) e dettagli inclusi in esse. Questi possono essere, ad esempio, sottili sezioni colorate di tessuti animali e vegetali, sottili sezioni di minerali, ecc.

Metodo del campo oscuro e sue varietà
Viene utilizzato uno speciale condensatore che evidenzia le strutture contrastanti del materiale non colorato. In questo caso i raggi dell'illuminatore cadono sulla preparazione con un angolo obliquo e l'oggetto di studio appare illuminato in campo scuro.

Metodo del contrasto di fase
Quando la luce passa attraverso oggetti colorati, l'ampiezza dell'onda luminosa cambia e quando la luce passa attraverso oggetti non colorati, cambia la fase dell'onda luminosa, che viene utilizzata per ottenere un'immagine ad alto contrasto.

Microscopia polarizzante
La microscopia polarizzante consente di studiare l'organizzazione ultrastrutturale delle componenti tissutali in base all'analisi dell'anisotropia e/o della birifrangenza

Metodo del contrasto di interferenza
Il metodo del contrasto di interferenza (microscopia di interferenza) consiste nel fatto che ogni raggio si divide in due, entrando nel microscopio. Uno dei raggi ottenuti è diretto attraverso la particella osservata, l'altro - oltre ad essa lungo lo stesso ramo ottico o aggiuntivo del microscopio. Nella parte oculare del microscopio, entrambi i raggi si ricollegano e interferiscono l'uno con l'altro. Uno dei raggi, attraversando l'oggetto, è in ritardo di fase (acquisisce una differenza di percorso rispetto al secondo raggio). Il valore di questo ritardo è misurato dal compensatore

Metodo di ricerca alla luce della luminescenza
Il metodo di ricerca alla luce della luminescenza (microscopia a luminescenza, o microscopia a fluorescenza) consiste nell'osservare al microscopio il bagliore verde-arancio dei microoggetti, che si verifica quando sono illuminati con luce blu-violetta o raggi ultravioletti non visibili all'occhio.

microscopia ultravioletta. Si basa sull'uso di raggi ultravioletti con una lunghezza d'onda inferiore a 380 nm, che consente di aumentare la risoluzione delle lenti da 0,2 ... 0,3 micron a 0,11 micron. Richiede l'uso di speciali microscopi ultravioletti che utilizzano illuminatori ultravioletti, ottiche al quarzo e convertitori da UV a visibile. Molte sostanze che compongono le cellule (ad esempio gli acidi nucleici) assorbono selettivamente i raggi ultravioletti, che vengono utilizzati per determinare la quantità di queste sostanze nella cellula.

Microscopia a trasmissione. Nei microscopi a trasmissione, gli elettroni passano attraverso il campione. L'energia dell'elettrone è relativamente bassa (fino a 50 kV); allo stesso tempo, vengono dispersi e assorbiti. Per creare un'immagine di contrasto, vengono utilizzati metodi speciali di preparazione del materiale.

Microscopi elettronici a scansione basato sulla scansione del campione. In questo caso, un fascio di elettroni focalizzato con precisione scorre sulla superficie del campione e gli elettroni riflessi formano un'immagine simile a quella tridimensionale. La risoluzione di un microscopio a scansione è inferiore a quella di un microscopio a trasmissione (5…20 nm).

Microscopi elettronici ad alta tensione si basano sull'utilizzo di elettroni ad altissima energia (fino a 1 MV - un milione di volt). Fasci così potenti perforano sezioni relativamente spesse (fino a 5 µm), il che rende possibile utilizzare questo tipo di microscopia per studiare le cellule intatte.

Metodo di congelamento: scheggiatura.

Le cellule vengono congelate alla temperatura di azoto liquido (196°C) in presenza di un crioprotettore e utilizzate per produrre chip. I piani di clivaggio passano attraverso il centro idrofobo del doppio strato lipidico. La superficie interna esposta delle membrane è ombreggiata con platino, le repliche risultanti sono studiate in una scansione EM. Quindi, solitamente in una camera a vuoto, il ghiaccio in eccesso viene rimosso mediante sublimazione. Questa operazione è chiamata incisione. Dopo l'incisione, il rilievo nel piano di sfaldatura diventa più pronunciato. campione ricevuto ombreggiato, cioè un sottile strato di metalli pesanti viene depositato sulla superficie del campione.

Colture tissutali, microrgia.

Metodo di coltura cellulare e tissutale

è far crescere cellule e tessuti al di fuori del corpo in mezzi nutritivi artificiali. Il metodo consente di studiare le reazioni delle cellule a varie influenze, i meccanismi di regolazione della proliferazione, differenziazione e morte.

Microurgia(micrurgia; micr + ergon - lavoro, azione) - un insieme di tecniche metodologiche e mezzi tecnici per eseguire operazioni su oggetti molto piccoli: organismi unicellulari, singole cellule, strutture multicellulari, intracellulari.

Ingegneria cellulare, concetto di eterokarion, ibridazione.

Heterokarion- una cellula somatica formata dalla fusione di cellule parentali con nuclei aploidi geneticamente diversi. Gli eterocarioni risultanti danno origine a due cellule ibride mononucleari.

Nel 1965, lo scienziato inglese G. Harris ottenne per la prima volta eterocari formati da cellule di topo e umane.

L'ibridazione è il processo di formazione o di ottenimento ibridi, che si basa sulla combinazione del materiale genetico di diverse cellule in una cellula

Indice dei "Metodi soggetti di isolamento di batteri. Microscopia. Terreni nutritivi per la coltivazione di batteri.":

Microscopia polarizzante consente l'imaging di strutture anisotrope non colorate (come fibre di collagene, miofibrille o cellule di microrganismi). Il principio del metodo si basa sullo studio di un oggetto in luce formato da due fasci polarizzati in piani reciprocamente perpendicolari.

Riso. 11-4. Schema di un microscopio a fluorescenza.

microscopia ad interferenza

microscopia ad interferenza combina i principi della microscopia a contrasto di fase e di polarizzazione. Il metodo viene utilizzato per ottenere un'immagine tridimensionale contrastante di oggetti non dipinti. Il principio del metodo si basa sulla biforcazione del flusso luminoso al microscopio; un raggio passa attraverso l'oggetto, l'altro lo oltrepassa. Entrambi i raggi sono collegati nell'oculare e interferiscono tra loro.

Riso. 11-5. Immunofluorescenza diretta. Il metodo diretto prevede l'uso di AT marcato con un colorante fluorescente per l'Ag di interesse; Gli AT interagiscono con Ag nei luoghi della loro localizzazione, il che rende possibile visualizzare l'etichetta.

Microscopia a fluorescenza

Metodo di microscopia luminescente basato sulla capacità di alcune sostanze di emettere luce se esposte a radiazioni a onde corte. In questo caso, le onde luminose emesse sono più lunghe della lunghezza d'onda che provoca il bagliore. In altre parole, gli oggetti fluorescenti assorbono la luce di una lunghezza d'onda ed emettono luce in una diversa regione dello spettro (Fig. 11-4). Ad esempio, se la radiazione inducente è blu, il bagliore risultante potrebbe essere rosso o giallo. Queste sostanze (isocianato di fluoresceina, arancio di acridina, rodamina, ecc.) sono utilizzate come coloranti fluorescenti per osservare oggetti fluorescenti (luminescenti). In un microscopio a fluorescenza, la luce proveniente da una sorgente (una lampada al mercurio ad altissima pressione) passa attraverso due filtri.

Riso. 11-6. Immunofluorescenza indiretta. Il metodo indiretto prevede l'uso di due diversi AT. I primi AT reagiscono con l'Ag del microrganismo, i secondi AT (associati all'etichetta) interagiscono specificamente con i primi AT, che sono Ag ai secondi AT. Il metodo è molto più sensibile dell'immunofluorescenza diretta, poiché diverse molecole del secondo AT si legano a ciascuna molecola del primo AT.

Primo filtro (blu). intrappola la luce davanti al campione e la trasmette a una lunghezza d'onda che eccita la fluorescenza nel campione. Il secondo (giallo) ritarda la luce blu, ma passa la luce gialla, rossa, verde emessa da un oggetto fluorescente e percepita dall'occhio. Di solito, i microrganismi studiati vengono colorati direttamente o con l'aiuto di AT o lectine marcate con fluorocromi. I farmaci interagiscono con Ag o altre strutture leganti ligando dell'oggetto. Microscopia a fluorescenza ha trovato ampia applicazione per la visualizzazione dei risultati di reazioni immunochimiche basate sull'interazione specifica di AT marcato con coloranti fluorescenti con Ag dell'oggetto in esame. Opzioni reazioni di immunofluorescenza sono presentati in fig. 11-5 e 11-6.

Glossario:

• La luce polarizzata è onde luminose che vibrano in una direzione.

• Un'onda luminosa è una radiazione elettrica e magnetica con un piano di oscillazione perpendicolare al piano di propagazione dell'onda.
• Un polarizzatore (Nicol I) è un dispositivo che consente il passaggio solo della luce completamente o parzialmente polarizzata. Progettato per trasmettere luce polarizzata (attraverso) l'oggetto trasparente in esame e tagliare (diffondere) la luce non polarizzata (luce naturale, luce artificiale, inclusa la radiazione di un illuminatore per microscopio). L'intensità della luce che passa attraverso il polarizzatore cade in proporzione al quadrato del coseno dell'angolo tra i piani di polarizzazione del polarizzatore e dell'analizzatore (legge di Malus):

Dove: I è l'intensità prima di passare attraverso il polarizzatore, I è l'intensità della luce dopo aver attraversato il polarizzatore, φ è l'angolo tra i piani di polarizzazione della luce polarizzata e il polarizzatore.

• Analizzatore (Nicol II) - un dispositivo simile a un polarizzatore, ma progettato per analizzare la luce polarizzata.

Rotazione dell'analizzatore rispetto al polarizzatore di un angolo ϕ. L'intensità della luce è indicata dalla freccia rossa.

• Un compensatore è un dispositivo per determinare le caratteristiche quantitative della polarizzazione. Converte un'immagine visibile ad alto contrasto in un'immagine a colori attenuando determinate lunghezze d'onda nella luce bianca.
• La luce polarizzata linearmente è luce con un piano di oscillazione limitato in una direzione e che si propaga in un piano.
• La fase delle oscillazioni dell'onda luminosa, da un punto di vista matematico, è l'argomento della funzione dell'onda luminosa, cioè ωt+φ 0 nella funzione sin(ωt+φ 0). Fisicamente, è un certo stato elettromagnetico in un certo momento.

• La lunghezza d'onda è la distanza tra due punti più vicini che si trovano nella stessa fase.

• La riflessione è un cambiamento nella direzione dell'onda. La riflessione totale è un cambiamento nell'angolo di rifrazione di un'onda inferiore a 90 °.

• La rifrazione è un cambiamento nella direzione di un'onda al confine di due mezzi. La birifrangenza è la scissione di un raggio di luce in un mezzo anisotropo in due raggi.

Figura 4 - Rifrazione dei raggi in un cristallo di longarone islandese.

• Il dicroismo è l'assorbimento parziale della luce da parte di una sostanza, a seconda della sua polarizzazione.

• L'interferenza è la variazione dell'intensità della luce quando due o più onde luminose si sovrappongono.

• La differenza nel percorso dei raggi luminosi è un valore che caratterizza la decelerazione della velocità della luce quando attraversa una sostanza trasparente. La differenza di percorso è misurata dalla distanza percorsa dalla luce nel vuoto per lo stesso tempo necessario per il passaggio nella sostanza in esame, nei punti studiati nello spazio.

• La conoscopia è un metodo per studiare le proprietà ottiche di oggetti anisotropi in fasci convergenti di luce polarizzata. Durante la conoscopia, i cambiamenti nel modello di interferenza vengono monitorati quando l'analizzatore viene ruotato. Ruotando l'analizzatore e il polarizzatore l'uno rispetto all'altro, il ricercatore osserva al microscopio figure conoscopiche, costituite da isogire (si tratta di bande scure corrispondenti alla direzione di oscillazione delle onde luminose nel polarizzatore) e isocromie (si tratta di bande di diversi colori di interferenza che corrispondono alle direzioni dei raggi nel cristallo con la stessa differenza di percorso).

• L'ortoscopia è un metodo per studiare le proprietà ottiche di oggetti anisotropi in fasci paralleli di luce polarizzata.

• Il pleocroismo è un cambiamento nel colore osservato di alcuni oggetti anisotropici con un cambiamento nell'angolo di visione (cambiamento nel colore dei cristalli quando il tavolo viene ruotato).

Un microscopio polarizzatore è un microscopio progettato per studiare la birifrangenza della luce polarizzata che passa attraverso un mezzo anisotropico.

Il primo microscopio polarizzatore fu progettato nel 1863 da Henry Clifton Sorby e differiva dal microscopio ottico a cui siamo abituati per due prismi Nicol installati nel percorso ottico. Il prisma Nicol trasmette la luce attraverso se stesso solo in una direzione e in un piano, cioè luce polarizzata piana, il resto della luce che entra in questi prismi viene completamente riflessa e diffusa. Questi prismi strutturalmente non differiscono l'uno dall'altro e fungono da polarizzatori (analizzatore e polarizzatore). Quando il piano di polarizzazione dell'analizzatore viene ruotato di 90º rispetto al piano di polarizzazione del polarizzatore, il ricercatore osserva il modello di polarizzazione di un oggetto birifrangente e tutti gli oggetti che non hanno birifrangenza vengono oscurati. Nei microscopi moderni, è possibile utilizzare prismi DIC (che combinano il rilievo con il modello di polarizzazione, per studiare campioni non colorati), compensatori (per polarizzazione quantitativa), una tavola rotonda (per studiare il pleocroismo) e semplici polaroid per semplici osservazioni (ad esempio, in biologia e medicina) per ottenere maggiori informazioni.

La polarizzazione è più spesso utilizzata nei microscopi cristallografici, dove le proprietà degli oggetti anisotropici possono essere determinate utilizzando la conoscopia e l'ortoscopia. Prestare attenzione alle somiglianze e alle differenze tra la conoscopia e le ortoscopie: il raggio luminoso passa attraverso il polarizzatore (1), è limitato dal diaframma di apertura (2), passa attraverso le lenti condensatrici (3); analizzatore (che trasforma il ricercatore) (8) e compensatori (7).

Figura 1 - Schema di un microscopio polarizzatore per: a) Ortoscopia b) Conoscopia

Legenda: 1 - polarizzatore, 2.6 - diaframmi; 3 - condensatore; 4 - droga; 5 - lente; 7 - compensatore; 8 - analizzatore; 9 - Lente di Bertrand; 10 - piano focale dell'oculare; 11 - oculare.

L'immagine osservata è costituita da figure conoscopiche. figure conoscopiche - sono costituite da isogiri (si tratta di strisce scure diritte o curve in cui le direzioni di vibrazione sono parallele alle sezioni principali dei nicols) e isocromi (si tratta di strisce dipinte con diversi colori di interferenza. Ogni striscia corrisponde alle direzioni dei raggi formati durante la birifrangenza e con la stessa differenza di percorso).

Facciamo un esempio: nelle lastre di un cristallo uniassiale tagliato perpendicolarmente all'asse ottico, vedremo un'isogira a forma di croce e anelli isocromi concentrici, vedi Fig. 5.

Figura 5 - A) Figureconoscopiche di un minerale di calcite uniassiale B) Minerale di flogopite biassiale con inserito un compensatore.

Dalla natura del modello di interferenza ottenuto, vengono misurati il ​​​​valore di birifrangenza, gli angoli di rotazione del piano di polarizzazione, gli angoli di estinzione, il numero di assi ottici e altre caratteristiche. Tutte queste caratteristiche rendono chiaro quale cristallo sta osservando il ricercatore, la sua struttura. Microscopi come il BX53P e l'H600P sono stati progettati per la mineralogia e la cristallografia. Sono dotati delle migliori ottiche e compensatori senza stress realizzati con attrezzature moderne, eliminando giochi e lacune quando vengono installati nel microscopio.

La birifrangenza è utilizzata non solo in cristallografia, ma anche in medicina, biologia, medicina legale e metallografia, perché è importante per i ricercatori isolare rapidamente e accuratamente vitamine, acidi, minerali, sollecitazioni in oggetti isotropici, inclusioni non metalliche nel campione originale e altri. Ad esempio, i microscopi per istologia e citologia sono dotati di polarizzatori per rilevare vari tipi di oggetti. Oggetti rotondi con un diametro di circa 2,4 micron, lipoidi e gocce, con polarizzatori incrociati formano un modello di interferenza della croce maltese. Non tutte le sostanze hanno le stesse proprietà di rifrazione a diverse temperature, quindi, ad esempio, si possono distinguere 1) sostanze che acquisiscono proprietà anisotrope quando vengono raffreddate e le perdono quando riscaldate: colesterolo e suoi esteri 2) non perdono le loro proprietà anisotrope quando riscaldate: cerebrosidi, fosfatidi, mieline. Tale variabilità delle proprietà è dovuta alla capacità di una sostanza di mantenere una struttura cristallina, tk. Questo è ciò che causa la birifrangenza. Osservando oggetti anisotropici in un microscopio polarizzante e determinandone la concentrazione, è possibile diagnosticare malattie come: artrite, aterosclerosi, lipoiduria, cilinuria e lipidosi dal bagliore dei lipidi con polarizzatori incrociati, nonché gotta, urolitiasi, selicosi e amianto rispettivamente da cristalli di urea, biossido di silicio e fibre di amianto. Per l'istologia e la citologia è stato sviluppato il microscopio BX46, dotato di un tavolino basso, un potente illuminatore e un tubo regolabile in altezza, che salverà la schiena del ricercatore dall'assorbimento.

La colorazione diversa dagli oggetti isotropi alla luce polarizzata è: amido, cellulosa, alcuni acidi, vitamina C, quindi anche i microscopi per la farmacologia e la farmaceutica dovrebbero essere dotati di polarizzatori. Un microscopio farmacologico include sia CX43 che BX43 e altri modelli, perché ogni anno ci sono sempre più ricerche in quest'area e nuovi oggetti di ricerca richiedono un approccio diverso.

Nella scienza forense è importante distinguere le inclusioni di grani di quarzo e altri minerali da sostanze organiche e altri materiali che possono essere trovati sulla scena del crimine, quindi il microscopio deve essere dotato di luce riflessa per visualizzare anche oggetti opachi. Il microscopio BX53M è adatto per la medicina legale, poiché è dotato non solo di una potente sorgente di luce trasmessa, ma anche dello stesso potente illuminatore a luce riflessa, e gli inserti per aumentare la distanza di lavoro del microscopio ti permetteranno di studiare oggetti molto grandi senza una lunga preparazione preliminare.

I microscopi polarizzatori sono utilizzati anche in metallografia, ma per tali studi è sufficiente conoscere la presenza o l'assenza di oggetti anisotropi, nonché la loro distribuzione spaziale. È per la classificazione e il conteggio di tali oggetti che i microscopi VHX6000, BX53P con Stream installato possono essere utilizzati in metallografia.