Aplicación de la espectrometría de masas en tándem (HPLC-MSMS) en el diagnóstico clínico. Aplicación de la espectrometría de masas en tándem (HPLC-MSMS) en el diagnóstico clínico Materiales y métodos

Palabras clave

ESTEROIDES / LÍPIDOS / SUERO SANGUÍNEO / PERFIL METABÓLICO / RESIDUOS INDUSTRIALES/ ESTEROIDES / LÍPIDOS / SUERO SANGUÍNEO / PERFIL METABÓLICO / RESIDUOS INDUSTRIALES

anotación artículo científico sobre ciencias veterinarias, autor del trabajo científico - Chakhovsky Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

El impacto de los factores antropogénicos tiene un efecto multifacético en el cuerpo humano y animal. Debido a su complejo impacto, identificar los efectos negativos de factores individuales es una tarea bastante difícil. Se utilizó una metodología metabolómica, que permite superar estas dificultades, para evaluar la naturaleza y el alcance de la influencia de los desechos de la producción de fertilizantes potásicos en los perfiles lipídicos de animales de experimentación durante la preparación intranasal con desechos de la producción de fertilizantes potásicos y consumo agua potable, obtenido de fuentes ubicadas en la zona potencial de producción de potasa. La separación de los lípidos del suero se llevó a cabo mediante una técnica especialmente desarrollada basada en la extracción en fase sólida, que permite eliminar el colesterol de las muestras. Cada muestra se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección espectrométrica de masas (HPLC-MS), después de lo cual los cromatogramas resultantes se procesaron mediante análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados. La técnica desarrollada permite separar eficazmente los metabolitos hidrófobos en el suero sanguíneo. Se estableció el perfil lipídico del suero sanguíneo de animales de experimentación, en particular el contenido de fosfolípidos y oxiesteroides, y se encontraron diferencias en los procesos metabólicos entre los animales de experimentación y los de control. En el suero sanguíneo de los animales de experimentación, la concentración de oxisteroides aumentó en comparación con el grupo de control.

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ANÁLISIS DE PERFILES DE LÍPIDOS EN SUERO EN COBAYAS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA DE CAMBIOS EN EL METABOLISMO BAJO EXPOSICIÓN A CONTAMINANTES AMBIENTALES

La exposición a factores antropogénicos tiene efectos multifacéticos en el cuerpo de humanos y animales. Debido a su compleja influencia, la detección de los efectos negativos de determinados factores es una tarea bastante complicada. La metodología metabolómica que permite superar estas dificultades se ha aplicado en la evaluación de la naturaleza y el grado del impacto de los desechos de la producción de fertilizantes potásicos en los perfiles lipídicos de animales de experimentación después de la inoculación intranasal con desechos de la producción de fertilizantes potásicos y el consumo de agua potable obtenida de fuentes. ubicado en la zona de acción potencial de la producción de fertilizantes potásicos. Se realizó el aislamiento de lípidos del suero. con el ayuda de una técnica especialmente desarrollada basada en la extracción de muestras en fase sólida que permite eliminar el colesterol de las muestras. Cada muestra se sometió a análisis HPLC-MS, después de lo cual los cromatogramas obtenidos se trataron con el uso del método de análisis de componentes principales y análisis de conglomerados. La técnica desarrollada permite separar eficazmente los metabolitos hidrófobos en el suero sanguíneo. Se estableció un perfil de lípidos séricos de los animales de experimentación, en particular el contenido de fosfolípidos y oxiesteroides, y se encontraron diferencias en los procesos metabólicos de los animales de prueba y de control. Se ha demostrado que en el suero de los animales de experimentación se observa una mayor concentración de hidroxiesteroide en comparación con el grupo de control.

Texto del trabajo científico. sobre el tema "Método HPLC-MS para analizar los perfiles lipídicos del suero sanguíneo de cobaya para identificar cambios tempranos en el metabolismo cuando se exponen a contaminantes ambientales"

[hiena y saneamiento 3/2014

Chakhovsky P.A.1, Yantsevich A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

TÉCNICA HPLC-MS PARA EL ANÁLISIS DE PERFILES DE LÍPIDOS EN SUERO

conejillos de indias para detectar cambios metabólicos tempranos cuando se exponen a contaminantes ambiente

TU "Centro Republicano Científico y Práctico de Higiene", 220012, Minsk, República de Bielorrusia; ^Instituto de Química Bioorgánica de la Academia Nacional de Ciencias de Bielorrusia, 220141, Minsk, República de Bielorrusia

El impacto de los factores antropogénicos tiene un efecto multifacético en el cuerpo humano y animal. Debido a su complejo impacto, identificar los efectos negativos de factores individuales es una tarea bastante difícil. Se utilizó la metodología metabolómica, que permite superar estas dificultades, para evaluar la naturaleza y el grado de influencia de los desechos de la producción de fertilizantes potásicos en los perfiles lipídicos de animales de experimentación durante la inoculación intranasal con desechos de la producción de fertilizantes potásicos y su consumo. de agua potable obtenida de fuentes ubicadas en la zona de acción potencial de la producción de potasa. La separación de los lípidos del suero se llevó a cabo mediante una técnica especialmente desarrollada basada en la extracción en fase sólida, que permite eliminar el colesterol de las muestras. Cada muestra se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección espectrométrica de masas (HPLC-MS), después de lo cual los cromatogramas resultantes se procesaron mediante análisis de componentes principales (PCA) y análisis de conglomerados. La técnica desarrollada permite separar eficazmente los metabolitos hidrófobos en el suero sanguíneo. Se estableció el perfil lipídico del suero sanguíneo de animales de experimentación, en particular el contenido de fosfolípidos y oxiesteroides, y se encontraron diferencias en los procesos metabólicos entre los animales de experimentación y los de control. En el suero sanguíneo de los animales de experimentación, la concentración de oxisteroides aumentó en comparación con el grupo de control.

Palabras clave: esteroides; lípidos; tranfusion de sangre; perfil metabólico; residuos industriales.

P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANÁLISIS DE PERFILES DE LÍPIDOS EN SUERO EN COBAYAS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA DE CAMBIOS EN EL METABOLISMO BAJO EXPOSICIÓN A CONTAMINANTES AMBIENTALES

1Centro Republicano Científico y Práctico de Higiene, Minsk, República de Bielorrusia, 220012; 2 Instituto de Química Bioorgánica, Minsk, República de Bielorrusia, 220141

para correspondencia: Chakhovsky Pavel Anatolyevich, chahovsky@gmail. com

La exposición a factores antropogénicos tiene efectos multifacéticos en el cuerpo de humanos y animales. Debido a su compleja influencia, la detección de los efectos negativos de determinados factores es una tarea bastante complicada. La metodología metabolómica que permite superar estas dificultades se ha aplicado en la evaluación de la naturaleza y el grado del impacto de los desechos de la producción de fertilizantes potásicos en los perfiles lipídicos de animales de experimentación después de la inoculación intranasal con desechos de la producción de fertilizantes potásicos y el consumo de agua potable obtenida de fuentes. ubicado en la zona de acción potencial de producción de fertilizantes potásicos. El aislamiento de lípidos del suero se realizó con la ayuda de una técnica especialmente desarrollada basada en la extracción de muestras en fase sólida, que permite eliminar el colesterol de las muestras. Cada muestra se sometió a análisis HPLC-MS, después de lo cual los cromatogramas obtenidos se trataron con el uso del método de análisis de componentes principales y análisis de conglomerados. La técnica desarrollada permite separar eficazmente los metabolitos hidrófobos en el suero sanguíneo. Se estableció un perfil de lípidos séricos de los animales de experimentación, en particular el contenido de fosfolípidos y oxiesteroides, y se encontraron diferencias en los procesos metabólicos de los animales de prueba y de control. Se ha demostrado que en el suero de los animales de experimentación se observa una mayor concentración de hidroxiesteroide en comparación con el grupo de control.

Palabras clave: esteroides, lípidos, suero sanguíneo, perfil metabólico, desechos industriales.

Introducción

Una de las tareas más importantes Biologia de sistemas y genética funcional: integración de proteómica, transcriptómica e información sobre los procesos metabólicos que ocurren en el cuerpo. Cualquier enfermedad o proceso patológico que ocurra en el organismo se refleja en el contenido de metabolitos de bajo peso molecular en los tejidos y la sangre. Para las características integrales de los metabolitos de bajo peso molecular en el plasma sanguíneo, en 1971 se introdujo el término "perfil metabólico". Debido a que el análisis simultáneo de múltiples clases de metabolitos es extremadamente difícil y poco práctico, comúnmente se usa una serie de técnicas para estudiar los perfiles metabólicos, incluida la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de alta resolución y la cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Como regla general, al realizar estudios metabolómicos, se limitan a un determinado grupo de sustancias que se separan de otros componentes durante la preparación de la muestra. Los datos del grupo resultante son más fáciles de interpretar.

Los perfiles metabólicos (particularmente orina y plasma sanguíneo) pueden usarse para determinar la naturaleza de los cambios fisiológicos causados ​​por la ingesta de compuestos tóxicos. En muchos casos, los cambios observados pueden proporcionar una caracterización adicional de lesiones específicas, como el hígado y el tejido adiposo.

El análisis de esteroides y lípidos en el suero sanguíneo tiene un gran potencial diagnóstico. La composición lipídica del suero sanguíneo, las hormonas esteroides, sus precursores y los productos de sus transformaciones metabólicas caracterizan muchos parámetros funcionales del organismo. Estas sustancias desempeñan un importante papel coordinador en la regulación del metabolismo y la función cardiovascular y participan en la respuesta del organismo al estrés agudo y crónico.

El perfil de esteroides es un criterio de diagnóstico único para una serie de enfermedades ginecológicas y oncológicas asociadas con una síntesis y un metabolismo alterados de las hormonas esteroides, mientras que algunas de ellas sólo pueden diagnosticarse mediante el perfil de esteroides. En el análisis de perfiles, la posibilidad de utilizar valores absolutos como variables simples y compararlos con la norma es muy significativa. Sin embargo, cambiar la proporción de cantidades puede ser más importante. Además, el perfil de esteroides proporciona información sobre una gran cantidad de esteroides al mismo tiempo.

Determinación del perfil de esteroides séricos - método efectivo identificar casi todos los trastornos del metabolismo de los esteroides, lo que permite diagnosticar

diagnóstico preciso en muchas situaciones clínicas, por ejemplo, en hiperplasia suprarrenal congénita, hiperaldosteronismo tipo I, hiperaldosteronismo primario, enfermedad de Itsenko-Cushing, insuficiencia suprarrenal, etc. El perfil de esteroides es importante en el diagnóstico de trastornos de la diferenciación sexual y de la función gonadal, así como así como insuficiencia hipotalámica pituitaria-suprarrenal.

La ingesta excesiva de sal, que es el componente predominante de los desechos de fertilizantes potásicos, en el cuerpo de ratas experimentales con exceso de peso corporal conduce a una activación excesiva de la síntesis de aldosterona y causa hipertensión y daño renal con síndrome metabólico.

En regiones de producción industrial con alto grado Debido a la contaminación ambiental, la tasa de morbilidad de la población suele ser más alta que en regiones relativamente “limpias”. El objeto de nuestra investigación fue la ciudad de Soligorsk, ubicada en la zona de extracción y procesamiento a gran escala de minerales de potasa. En las zonas de vertederos de sal y depósitos de lodos de las plantas de potasa se ha formado una zona de salinidad de cloruro de sodio que cubre las aguas subterráneas hasta una profundidad de más de 100 m, lo que puede afectar la contaminación de las fuentes de suministro de agua potable y del aire atmosférico. .

Para evaluar el impacto de la contaminación de componentes ambientales individuales en la región de producción industrial de fertilizantes potásicos, analizamos los perfiles de lípidos del suero sanguíneo como indicador de trastornos metabólicos tempranos bajo la influencia de una mezcla de sustancias químicas.

El objetivo del trabajo es identificar cambios metabólicos en animales de laboratorio con exposición a desechos provenientes de la producción de fertilizantes potásicos y consumo de agua potable obtenida de fuentes potencialmente afectadas por desechos de producción, utilizando el método de cromatografía líquida de alta resolución con detección espectrométrica de masas. (HPLC-EM).

El objeto del estudio fue el suero sanguíneo de animales de experimentación (cobayas) de los grupos experimental y de control.

Materiales y métodos

Se llevaron a cabo estudios experimentales en 35 cobayas (17 hembras y 18 machos) que pesaban entre 305 y 347 g.

[hiena y saneamiento 3/2014

Grupo experimental (cebado con residuos de la producción industrial de fertilizantes potásicos y agua potable del sistema de abastecimiento de agua de Soligorsk), 20 personas (10 mujeres y 10 hombres);

Grupo de control (cebado con solución isotónica de cloruro de sodio para excluir los efectos del factor de estrés causado por el procedimiento de cebado), 15 individuos (8 hombres y 7 mujeres).

Durante el experimento se controló diariamente el estado general de los animales, el consumo de alimento y agua.

Para modelar la exposición crónica por inhalación (12 semanas) a los desechos de la producción de fertilizantes potásicos, nos guiamos por MU.No. 11-11-10-2002 “Requisitos para realizar estudios toxicológicos y alergológicos durante la regulación higiénica de aerosoles que contienen proteínas en el aire del área de trabajo”, incluida la determinación de la dosis de cebado. Las muestras de los vertederos de sal se trituraron en un mortero de mármol hasta obtener un estado polvoriento homogéneo, se disolvieron en agua destilada hasta la concentración requerida, teniendo en cuenta el peso corporal de los animales de experimentación (el peso corporal se controló semanalmente para ajustar la dosis). Las dosis calculadas fueron: al inicio del experimento - 2,028 mg/0,1 cm3, después de 4 semanas - 2,85 mg/0,1 cm3, después de 6 semanas - 3,17 mg/0,1 cm3, después de 8 semanas y hasta el final del experimento 3,8 mg/0,1 cm3.

Se fijó a un conejillo de indias sin anestesia en posición supina con la cabeza levantada y se inyectó alternativamente una dosis de solución tibia en las fosas nasales (fraccionadamente) utilizando un dispensador de pipetas (durante 2-3 minutos) de tal manera que se evitara el estornudo. . Los sonidos de "aplastamiento" resultantes confirmaron la penetración de la solución en el tracto respiratorio.

El grupo experimental de animales “inhaló” la mezcla una vez al día, 5 días a la semana durante 12 semanas. Los animales del grupo de control "inhalaron" solución salina (NaCl al 0,9%).

Para recolectar material biológico, los animales fueron anestesiados (anestesia con éter) y, después de la decapitación, se extrajo sangre. El suero se obtuvo por centrifugación a 3000 rpm durante 15 minutos y se almacenó a -20 C para estudios posteriores. Se analizaron fosfolípidos, oxiesteroides y ácidos grasos en suero sanguíneo.

Preparación de la muestra. Se añadió un estándar interno, progesterona, al suero sanguíneo para alcanzar una concentración de 10-5 M (10 µl por 1 ml de muestra). Luego, para precipitar las proteínas contenidas en la muestra y extraer los esteroides, se añadió metanol hasta una concentración final del 70% (2,33 ml de metanol por 1 ml de muestra), seguido de una centrifugación durante 15 min a 10.000 g. Las proteínas contenidas en la muestra formaron un sedimento denso. El sobrenadante se separó del precipitado y se pasó a través de una columna de extracción en fase sólida (SPE) preacondicionada que contenía 100 mg de gel de sílice octadecilsililo. La columna SPE se acondicionó pasando sucesivamente 2 ml de metanol, 2 ml de agua y 2 ml de metanol al 70%. En la primera etapa, el colesterol, cuyo contenido en el plasma sanguíneo y otros fluidos biológicos es bastante alto, así como otros lípidos altamente hidrófobos, se une a la columna. Después de la unión del colesterol, la columna se lavó adicionalmente con 2 ml de metanol al 70%. Si hay un contenido alto de colesterol en la muestra o un volumen de muestra grande, use

Utilizamos una columna SPE con un alto contenido de sorbente. Los eluatos se combinaron y evaporaron. La evaporación se llevó a cabo a 50°C en una corriente de gas inerte. El residuo seco se disolvió en 500 µl de metanol y se centrifugó durante 10 min a 10.000 g. En este caso precipitaron compuestos polares insolubles en metanol. El sobrenadante se separó del sedimento y se diluyó con agua hasta una concentración de metanol del 10%. La solución resultante se pasó a través de una columna SPE preacondicionada (se pasaron 2 ml de metanol, 2 ml de agua y 2 ml de metanol al 10%) y se lavó con 2 ml de metanol al 10%. Los esteroides unidos a la columna se eluyeron con 3 ml de metanol al 80 %. La solución se evaporó y el residuo seco se disolvió en 100 µl de metanol. La solución resultante se analizó usando HPLC-MS.

Análisis por HPLC. El análisis se realizó en un cromatógrafo Accela equipado con un detector espectrométrico de masas LCQ-Fleet. La separación se realizó en una columna Cosmosil 5C18-MS-II con parámetros geométricos de 4,6*150 mm (Nacalai Tesque, Japón).

Programa de separación (disolvente A - agua, disolvente B - metanol, caudal 500 µl/min): durante 5 min 60 % B, 12 min - gradiente lineal 60-95 % B, 10 min - 95 % B, 8 min - lineal gradiente 95-100% B, 5 min - 100% B, 5 min - 60% B.

Se utilizó una fuente de ionización química a presión atmosférica (APCI) para el análisis espectrométrico de masas. Parámetros de la fuente de ionización: temperatura del evaporador - 350°C, flujo de gas de secado - 35 unidades, flujo de gas auxiliar - 5 unidades, temperatura del capilar - 275°C, voltaje del capilar - 18 V, voltaje de la lente de iones - 80 V. Escaneo Data Dependent™ usado Modo usando una trampa de iones en el rango de escaneo 50-1000 m/z.

Los cromatogramas obtenidos utilizando un detector espectrométrico de masas en el modo de ionización química (corriente iónica total) se convirtieron a formato de texto utilizando el programa Qual Browser del paquete Xcalibur (Thermo Sci, EE. UU.). La información obtenida se procesó utilizando el método de componentes principales implementado en el paquete Statistica 10 y herramientas para análisis de conglomerados y construcción de dendrogramas. El libro de referencia se utilizó para interpretar los espectros de masas e identificar compuestos individuales.

Resultados y discusión

El método inicial de adaptación fue el método de extracción en fase sólida de esteroides a partir de suero y plasma sanguíneo, descrito en el manual de extracción en fase sólida de Macherey-Nagel. Guía de aplicación, que proporciona recomendaciones para el uso de columnas de extracción en fase sólida. Una técnica adaptada de preparación de muestras con extracción en fase sólida permitió aislar eficazmente fosfolípidos, oxiesteroides y ácidos grasos del suero sanguíneo de cobayas.

La técnica de separación cromatográfica descrita permite separar eficazmente tanto las hormonas esteroides como los lípidos presentes en el suero.

Las muestras se analizaron según los métodos descritos. En la Fig. 1 (ver página 2 de la portada) muestra, a modo de ejemplo, cromatogramas superpuestos obtenidos del análisis de 3 muestras del grupo experimental (resaltadas

Arroz. 4. Espectros de masas de una sustancia con un tiempo de retención de 21,5 minutos: a - ionización química a presión atmosférica en modo negativo; b - ionización química a presión atmosférica en modo positivo.

en rojo) y 3 muestras del grupo control (en azul). En otros casos se observó un cuadro similar.

Para procesar estos conjuntos de datos, utilizamos el método de componentes principales (PCA) y el análisis de conglomerados, que permitieron identificar diferencias en los perfiles de lípidos entre los grupos de control y experimentales. Gráfico PCA del primer y segundo componente principal obtenidos

al reducir la dimensión de datos, se muestra en la Fig. 2 (ver segunda portada). En el gráfico es fácil notar que los puntos están combinados en 2 grupos, localizados en los cuadrantes 1, 4 y 2, 3, respectivamente. En este caso, los puntos correspondientes a los prototipos se localizan predominantemente en el 1º y 4º cuadrante, los puntos correspondientes a las muestras de control se localizan en el 2º y 3º cuadrante. El dendrograma obtenido colocando

[hiena y saneamiento 3/2014

Identificación de picos presentes en el cromatograma.

Tiempo de retención, min Picos principales en modo “+” Picos principales en modo “-”

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Sustancia

fosfatidilcolina

ácido araquídico

Ácido fosfatídico 42:4

Ácidos araquídico y docosato-traenoico

docosapentaenoico

Ácido linoleico

dihidroxicolesterol

Análisis del esternón, mostrado en la Fig. 3. Así, análisis estadístico Los datos cromatográficos indican diferencias en los procesos metabólicos que ocurren en los organismos de los animales de experimentación que pertenecen a los grupos de control y experimentales.

Para identificar cambios metabólicos específicos, se descifraron e identificaron espectros de masas.

Se especifican conexiones individuales (ver tabla). El volumen de muestra fue insuficiente para el análisis y no nos permitió detectar cambios en el perfil de hormonas esteroides en el suero. Sin embargo, en el cromatograma se detectaron lípidos con polaridad intermedia.

Los compuestos individuales se identificaron analizando los espectros de masas de sustancias registradas bajo diferentes modos de ionización. Así, en la figura 2 se presenta el espectro de masas de la sustancia en dos modos de ionización con un tiempo de retención de 21,5 min. 4. El análisis de este espectro mostró que la sustancia es diacil-sn-glicerofosfato con peso molecular 780 (R1(311) = 20:0 ácido graso (ácido araquídico), R2(331) = 22:4 ácido graso (ácido docosatetraenoico)).

Se encontró que el pico cromatográfico con un tiempo de retención de 42,52 min corresponde al dihidroxicolesterol, presumiblemente uno de los precursores en la biosíntesis de ácidos biliares. Las diferencias en el contenido de oxisteroides en el suero sanguíneo indican un posible trastorno en el metabolismo de los ácidos biliares. Se puede observar que en los cromatogramas presentados en la Fig. 1, en el suero sanguíneo de los animales de experimentación hay una mayor concentración de oxisteroides en comparación con el control (picos con un tiempo de retención de 35 a 45 minutos).

conclusión. La técnica utilizada en el trabajo permite detectar tempranamente trastornos del metabolismo de los lípidos cuando se exponen a contaminantes ambientales con un alto grado de eficacia. Los resultados obtenidos indican que la administración intranasal de soluciones acuosas de salmuera a animales experimentales de Cavia porcellus provoca cambios en el metabolismo de lípidos y oxiesteroides. En particular, los niveles elevados observados de precursores de ácidos biliares (hidroxiesteroides) en animales pueden estar asociados con una disfunción del hígado y de las enzimas implicadas en la biosíntesis de los ácidos biliares. Por tanto, el enfoque descrito se puede utilizar para identificar trastornos del metabolismo de los lípidos en residentes de regiones con contaminación tecnogénica.

Literatura

1. Horning E.C., Horning M.G. Perfiles metabólicos: métodos en fase gaseosa para el análisis de metabolitos. Clínico. Química. 1971; 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Aplicación de la metabonómica basada en RMN en la investigación de la isquemia-reperfusión miocárdica, el precondicionamiento isquémico y la intervención antioxidante en conejos. EUR. J. Farmacéutica. Ciencia. 2007; 30(3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett BD, Rabinowitz JD. Estrategias analíticas para metabolómica dirigida basada en LC-MS. J. Cromatogr. B.Analista. Tecnología. Biomédica. Ciencias de la vida. 2008; 871(2): 236-42.

4. Novotny M.V., Soini H.A., Mechref Y. Individualidad bioquímica reflejada en perfiles cromatográficos, electroforéticos y espectrométricos de masas. J. Cromatogr. B.Analista. Tecnología. Biomédica. Ciencias de la vida. 2008; 866(1-2): 26-47.

5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidómica y perfil lipídico en metabolómica. actual. Opinión. Lipidol. 2007; 18(1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Uso del perfil de esteroides mediante UPLC-MS/MS como prueba de segundo nivel en la detección de hiperplasia suprarrenal congénita en recién nacidos: la experiencia de Utah. Pediatra. Res. 2009; 66(2): 230-5.

7. Rauh M. Medición de esteroides con LC-MS/MS. Solicitud

Al arte. Chakhovsky et al.

Arroz. 3. Dendrograma construido sobre la base del análisis de conglomerados e ilustrando la agrupación de muestras en grupos.

Al arte. Chakhovsky et al.

Arroz. 1. Cromatogramas combinados de las muestras 1-3 del grupo de control (resaltadas en rojo) y 15-17 del grupo experimental (resaltadas en azul).

Proyección de los casos en el plano factorial (1 x 2) Casos con suma de coseno cuadrado >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■O

1 préstamo "Sh o 28/1" 22/10 41/1 p

Factor 1: 65,71%

Arroz. 2. Gráfico obtenido procesando cromatogramas usando PCA. El grupo de control está resaltado en azul y el grupo experimental en rojo.

El uso de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en laboratorios clínicos ha aumentado enormemente en los últimos 10 a 12 años, según una revisión publicada en Clinical Biochemist Reviews. Los autores señalan que la especificidad del análisis HPLC-MS/MS es significativamente superior a los métodos inmunológicos y a la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) clásica para el análisis de moléculas de bajo peso molecular y tiene un rendimiento significativamente mayor que la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC). -EM). La popularidad de este método en los análisis clínicos de rutina se explica actualmente por las capacidades únicas del método.

Las principales ventajas del método HPLC-MS/MS son:
• Posibilidad de análisis cuantitativo preciso de moléculas pequeñas;
• Análisis simultáneo de múltiples compuestos objetivo;
• Especificidad única;
• Alta velocidad de análisis.

EN últimos años Se presta mucha atención al tiempo de análisis y, como resultado, al aumento de la productividad del laboratorio. Se logran reducciones significativas en el tiempo de análisis mediante el uso de columnas analíticas cortas para HPLC/MS/MS, al tiempo que se aumenta drásticamente la especificidad del análisis. El uso de ionización a presión atmosférica (API), espectrómetro de masas de triple cuadrupolo en tándem y cromatografía líquida avanzada de alto rendimiento, así como técnicas de preparación de muestras asociadas, ha llevado a HPLC-MS/MS a la vanguardia de los métodos analíticos modernos para la investigación clínica.

Principales áreas de aplicación de HPLC/MS/MS en medicina clínica:
• Obtención de un perfil metabólico completo de paneles de esteroides, purinas y pirimidinas y otros compuestos,
  detección de errores congénitos del metabolismo en recién nacidos (detección de varias docenas de enfermedades en una sola prueba);
• Seguimiento terapéutico de los fármacos (inmunosupresores, peroticonvulsivos, antirretrovirales, anticoagulantes y otros) independientemente de la disponibilidad de los kits del fabricante. No es necesario comprar kits costosos para cada sustancia; usted puede desarrollar sus propios métodos;
• Toxicología clínica: análisis de más de 500 compuestos narcóticos y sus metabolitos en un solo análisis, sin análisis confirmatorio.
  proteómica y metabolómica.

Además, HPLC-MSMS se utiliza para la detección de oligosacáridos urinarios, sulfatida, ácidos grasos de cadena larga, ácidos biliares de cadena larga, ácido metilmalónico, estudios de porfiria y detección de pacientes con trastornos del metabolismo de las purinas y las pirimidinas.

Ejemplos de aplicación de cromatografía líquida.
en combinación con espectrometría de masas en tándem en análisis clínicos.

Cribado de recién nacidos: El primer ejemplo de uso generalizado de HPLC-MS/MS en el diagnóstico clínico fue la detección de errores congénitos del metabolismo en recién nacidos. Actualmente, en los países desarrollados este es un método rutinario y cubre más de 30 varias enfermedades, incluyendo acidemia, aminoacidopatía, defectos en la oxidación de ácidos grasos. De particular interés son los estudios sobre defectos de nacimiento que pueden provocar problemas graves si no se tratan con prontitud (por ejemplo, agrandamiento del corazón o del hígado o inflamación del cerebro). La ventaja de utilizar HPLC-MS/MS para la detección de recién nacidos es la capacidad de analizar simultáneamente todos los aminoácidos y acilcarnitinas de una manera rápida, económica y altamente específica.

Monitoreo terapéutico de medicamentos: El desarrollo y la introducción del fármaco inmunosupresor sirolimus (rapamicina) para prevenir el rechazo de órganos después del trasplante ha sido uno de los principales impulsores de la introducción de HPLC-MS/MS en los laboratorios clínicos. método moderno HPLC-MS/MS permite la determinación simultánea de tacrolimus, sirolimus, ciclosporina, everolimus y ácido micofenoico.

HPLC-MS/MS también se utiliza para el análisis de fármacos citotóxicos, antirretrovirales, antidepresivos tricíclicos, anticonvulsivos y otros fármacos que requieren dosis individuales.

El método HPLC-MSMS permite la separación y cuantificación de los enantiómeros R y S de warfarina en el rango de concentración de 0,1 a 500 ng/ml.

Narcóticos y analgésicos: HPLC-MS/MS se usa ampliamente para el análisis de estos compuestos debido a la facilidad de preparación de muestras y el corto tiempo de análisis. El método se utiliza actualmente en laboratorios clínicos para detectar la presencia de una amplia gama de fármacos. La especificidad y sensibilidad únicas del método hacen posible analizar simultáneamente más de 500 compuestos de varias clases en una muestra con una preparación mínima de la muestra. Así, en el caso del análisis de orina, basta con una simple dilución de la muestra entre 50 y 100 veces. Al analizar el cabello, en lugar de un manojo de 100 a 200 cabellos, un solo cabello es suficiente para identificar de manera confiable los hechos del consumo de drogas.

Endocrinología y análisis de esteroides: HPLC-MS/MS se utiliza ampliamente en muchos laboratorios de endocrinología para el análisis de esteroides: testosterona, cortisol, aldesterona, progesterona, estriol y muchos otros.

Cada vez más laboratorios están empezando a utilizar HPLC-MS/MS para determinar los niveles sanguíneos de vitamina D3 y D2.

I. Determinación de esteroides (perfil de esteroides).

Los laboratorios de hospitales y clínicas ahora tienen la capacidad de realizar determinaciones simultáneas de múltiples esteroides mediante HPLC/MS/MS. En este caso, no es necesario un gran volumen de muestra, lo cual es especialmente importante cuando se analizan muestras pediátricas.

Casos en los que es aconsejable determinar varios esteroides (perfilados):
• La hiperplasia suprarrenal congénita (CAH) es un defecto congénito en la biosíntesis de esteroides. Se trata de un grupo hereditario de enfermedades causadas por una actividad inadecuada de las enzimas de la corteza suprarrenal, lo que conduce a una disminución de la producción de cortisol. Para un diagnóstico fiable de NAS, se recomienda medir el cortisol, la androstenediona y la 17-hidroxiprogesterona. HPLC/MS/MS permite la cuantificación precisa de los tres esteroides en un solo análisis con 100% de confianza.
• La detección sistemática de recién nacidos mediante inmunoensayos difiere nivel alto resultados positivos y falsos negativos. La determinación mediante HPLC/MS/MS no sólo de cortisol, sino también de aldosterona y 11-desoxicortisol permite distinguir la insuficiencia suprarrenal primaria de la secundaria.
• HPLC/MS/MS permite la determinación de esteroides en prostatitis y síndrome de dolor pélvico crónico.
• HPLC-MS/MS puede determinar perfiles de esteroides e identificar causas de pubertad precoz relacionada con la corteza suprarrenal en niños pequeños. Se encontró que las concentraciones de testosterona, androstenediona, dehidroepiandrosterona (DHEA) y su sulfato en estos niños eran ligeramente más altas que en los niños mayores del grupo de control.
• Se analiza el suero de fumadores activos, fumadores pasivos y no fumadores para detectar la presencia de 15 hormonas esteroides y hormonas tiroideas para investigar la relación entre la exposición al humo del paciente y las concentraciones hormonales.
• HPLC/MS/MS se utiliza para perfilar algunas hormonas esteroides femeninas en la orina.
• Se utilizó HPLC/MS/MS para evaluar las concentraciones de hormonas neuroactivas para la prevención de la neuropatía diabética.

II. Determinación de hormonas tiroideas.

Los métodos de rutina para determinar las hormonas tiroideas generalmente se basan en radioinmunoensayos, que son costosos y solo detectan T3 y T4, lo que puede limitar la capacidad de determinar y regular completamente la función tiroidea.

• Actualmente, mediante HPLC-MSMS se realiza el análisis simultáneo de cinco hormonas tiroideas en muestras de suero, entre ellas tiroxina (T4), 3,3′,5-triyodotironina (T3), 3,3′,5′- (rT3) , 3,3'-diyodotironina (3,3'-T2) y 3,5-diyodotironina (3,5-T2) en el rango de concentración de 1 a 500 ng/ml.
• El método HPLC/MS/MS también se utiliza para analizar la composición hormonal en pacientes sometidos a tiroidectomía. Se determinan los niveles de concentración de tiroxina (T4), triyodotironina (T3), T4 libre y hormona estimulante de la tiroides (TSH) después de la cirugía. Se ha descubierto que HPLC/MS/MS es una excelente manera de establecer la relación entre la TSH y las concentraciones de hormona tiroidea.
• Se utilizó el método HPLC/MS/MS para determinar la tiroxina (T4) en saliva y suero humanos. El método se caracteriza por una alta reproducibilidad, precisión y un límite de detección de 25 pg/ml. Los estudios han demostrado que existe una relación diagnóstica en las concentraciones de T4 en saliva entre sujetos eutiroideos y pacientes con enfermedad de Graves.

El método HPLC/MS/MS ahora tiene la sensibilidad, especificidad y precisión necesarias para la determinación fiable de todos los esteroides en fluidos biológicos y, por lo tanto, mejora las capacidades de diagnóstico, especialmente en el caso de la determinación de conjuntos de esteroides.

III. Determinación de 25-hidroxivitamina D por HPLC/MS/MS

La 25-hidroxivitamina D (25OD) es la principal forma circulante de vitamina D y la precursora de su forma activa. (1,25-dihidroxivitamina D). Debido a su larga vida media, la determinación de 25OD es importante para determinar el estado de la vitamina D en el organismo del paciente. La vitamina D existe en dos formas: vitamina D3 (colecalciferol) y vitamina D2 (ergocalciferol). Ambas formas se metabolizan en sus respectivas formas de 25OD. De gran importancia para el diagnóstico es la disponibilidad de métodos analíticos que puedan determinar ambas formas de la vitamina con gran precisión y permitir el seguimiento de los pacientes con deficiencia de vitamina D. Los métodos utilizados hasta ahora no permitían la determinación separada de las vitaminas D2 y D3. Además, en concentraciones elevadas de vitamina D2, se subestima la cantidad detectable de D3. Otra desventaja es el uso de isótopos radiactivos. El uso del método HPLC/MS/MS permitió no sólo evitar el uso de isótopos radiactivos, sino también realizar la determinación por separado de ambos. formas activas vitamina A.

El método es aplicable para los siguientes pacientes:
1. Si sospecha un nivel bajo de vitamina D en el cuerpo;
2. Si se sospecha toxicidad inexplicable;
3. Al examinar a pacientes sometidos a tratamiento por niveles bajos de vitamina D;
4. El uso de HPLC/MS/MS permitió la determinación separada de ambas formas al monitorear a los pacientes.

IV. Determinación de inmunosupresores por HPLC/MS/MS

Después del trasplante de órganos, se deben tomar medicamentos inmunosupresores de por vida para evitar el rechazo. Con un rango terapéutico muy estrecho y una alta toxicidad, los inmunosupresores requieren dosificación individual para lograr el máximo efecto. Por tanto, la monitorización de los principales fármacos inmunosupresores: ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus y everolimus es vital para ajustar la dosis de los fármacos para cada paciente individual en función de la concentración del fármaco en sangre.

Todavía se utilizan inmunoensayos para monitorear estos medicamentos, pero estos métodos son costosos y tienen especificidad, precisión y reproducibilidad limitadas. Hay casos de muerte de pacientes por dosificación incorrecta de inmunosupresores según los resultados obtenidos mediante métodos inmunológicos. Actualmente, los inmunoensayos están siendo sustituidos en los laboratorios clínicos por HPLC/MS/MS. Así, en la clínica universitaria de Múnich se analizan diariamente unas 70 muestras para determinar el contenido de sirolimus y ciclosporina A mediante un sistema HPLC/MS/MS. Toda la preparación de muestras y el control de instrumentos lo lleva a cabo un empleado. El laboratorio también está empezando a probar tacrolimus utilizando este método.

• Se describe el uso de HPLC/MS/MS para la determinación simultánea de rutina de tacrolimus, sirolimus, ascomicina, demetixisirolimus, ciclosporina A y ciclosporina G en sangre. El rango determinado por la concentración es 1,0 - 80,0 ng/ml. Para ciclosporina 25 - 2000 ng/ml. Durante el año, el laboratorio analizó más de 50.000 muestras.
• Dado que se descubrió que el uso simultáneo de tacrolimus y sirolimus tiene un efecto terapéutico positivo, se desarrolló un método HPLC/MS/MS sencillo y eficaz para su determinación separada en sangre para análisis clínicos. El análisis de una muestra tarda 2,5 minutos con una precisión que oscila entre el 2,46% y el 7,04% para tacrolimus y entre el 5,22% y el 8,30% para sirolimus para toda la curva analítica. El límite inferior de detección de tacrolimus es de 0,52 ng/ml y de sirolimus de 0,47 ng/ml.

V. Determinación de homocisteína por HPLC/MS/MS

La homocisteína es de interés en enfermedades cardiovasculares (tromboembolismo, cardiopatías, aterosclerosis) y otras condiciones clínicas (depresión, enfermedad de Alzheimer, osteoporosis, complicaciones del embarazo, etc.). Los métodos actuales para el análisis de homocisteína, incluidos los inmunoensayos, son caros. Se ha desarrollado un método rápido de HPLC/MS/MS para el análisis de homocisteína para uso clínico rutinario en el análisis de grandes cantidades de muestras. La ionización se llevó a cabo mediante el método de electropulverización. El método es reproducible, muy específico y preciso. Las ventajas del método son también el bajo coste de los reactivos y la facilidad de preparación de las muestras. Es posible analizar 500 o más muestras por día.

Conclusión

Cabe señalar que, aunque ahora se utilizan métodos de inmunoensayo significativamente mejorados, debido a limitaciones técnicas fundamentales, este método nunca tendrá la precisión y especificidad para la sustancia objetivo comparable a la HPLC-MSMS, especialmente en presencia de metabolitos. Esto no sólo conduce a una baja precisión del método ELISA y a un alto porcentaje de resultados falsos positivos y falsos negativos, sino que tampoco permite comparar los resultados obtenidos en diferentes departamentos clínicos utilizando el método ELISA. El uso de HPLC-MS/MS elimina este inconveniente y permite un análisis altamente específico, preciso y rápido de una gran cantidad de muestras con alta confiabilidad en presencia de metabolitos y sin interferencias de sustancias concomitantes y endógenas que se encuentran en el plasma y la sangre. de pacientes.

A pesar del aparente alto costo del complejo de instrumentos, como muestra la práctica mundial, con un funcionamiento adecuado, este complejo se amortiza en 1 o 2 años. Esto se debe, en primer lugar, al bajo coste de un análisis debido al análisis simultáneo de decenas y cientos de compuestos y a la ausencia de la necesidad de adquirir costosos kits de diagnóstico. Además, el laboratorio tiene la oportunidad de desarrollar de forma independiente los métodos de análisis necesarios y no depender del fabricante del kit.

Seleccionar la configuración de instrumentación correcta

Existe una gran cantidad de diferentes métodos de espectrometría de masas y tipos de espectrómetros de masas diseñados para resolver una amplia variedad de problemas, desde la identificación estructural de macromoléculas de proteínas complejas que pesan cientos de miles de Dalton hasta el análisis cuantitativo rutinario de alto rendimiento de moléculas pequeñas.

Para resolver con éxito el problema, una de las principales condiciones es la elección del tipo de equipo adecuado. No existe un dispositivo universal que permita resolver toda la gama de problemas analíticos. Por tanto, un dispositivo diseñado para resolver el problema de la identificación de microorganismos no es capaz de realizar análisis cuantitativos de moléculas pequeñas. Y viceversa. El hecho es que, a pesar del nombre común, se trata de dispositivos completamente diferentes que funcionan según principios físicos diferentes. En el primer caso, se trata de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con una fuente de ionización láser (MALDI-TOF), y en el segundo, un triple cuadrupolo con ionización por electropulverización (HPLC-MSMS).

El segundo parámetro más importante es elegir la configuración correcta del sistema. Existen varios fabricantes importantes de equipos de espectrometría de masas. Los dispositivos de cada fabricante no solo tienen sus propias fortalezas, sino también debilidades, sobre las cuales generalmente prefieren guardar silencio. Cada fabricante produce su propia línea de dispositivos. El coste de un complejo analítico oscila entre 100.000 y 1.000.000 o más de dólares. Elegir el fabricante óptimo y la configuración correcta del equipo no solo ahorrará importantes recursos financieros, sino que también resolverá el problema de manera más eficiente. Desafortunadamente, hay muchos ejemplos en los que el equipamiento de laboratorio se realizó sin tener en cuenta estos factores. El resultado es equipo inactivo y dinero desperdiciado.

El tercer factor que determina el buen funcionamiento de un laboratorio es el personal. El funcionamiento de espectrómetros de masas requiere personal altamente calificado. Desafortunadamente, ni una sola universidad en Rusia tiene un curso sobre espectrometría de masas práctica moderna, especialmente en relación con las aplicaciones clínicas, y las tareas de formación del personal en cada laboratorio deben resolverse por sí solas. Naturalmente, 2 o 3 días de formación introductoria impartida por el fabricante después del lanzamiento del equipo no son en absoluto suficientes para comprender los conceptos básicos del método y adquirir habilidades en el funcionamiento del dispositivo.

El cuarto factor es la falta de métodos de análisis ya preparados. Cada laboratorio tiene su propio tareas prioritarias, para cuya solución es necesario desarrollar métodos propios. Esto lo puede realizar una persona que tenga al menos 2 o 3 años de experiencia en el manejo del dispositivo. A veces los fabricantes suministran uno o dos métodos generales de carácter recomendatorio, pero no los adaptan a las tareas específicas del laboratorio.

EN BioPharmExpert LLC Empleamos especialistas con muchos años de experiencia trabajando en varios tipos de espectrómetros de masas, además de desarrollar métodos y realizar análisis de alto rendimiento. Por ello brindamos los siguientes servicios:

1. Seleccionar la configuración óptima del dispositivo para las tareas específicas del cliente.
2. Compra, suministro y lanzamiento de equipos de los principales fabricantes de espectrómetros de masas en tándem Capacitación paso a paso del personal dentro de un año a partir de la fecha de lanzamiento del equipo.
3. Un conjunto de técnicas y bases de datos listas para usar para resolver problemas clínicos básicos.
4. Desarrollo de métodos de análisis y resolución de problemas específicos del cliente en su laboratorio con la implicación de su personal.
5. Apoyo metodológico en todas las etapas del trabajo.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método de cromatografía en columna en el que la fase móvil (MP) es un líquido que se mueve a través de una columna de cromatografía llena de una fase estacionaria (sorbente). Las columnas de HPLC se caracterizan por una alta presión hidráulica en la entrada de la columna, razón por la cual a la HPLC a veces se la denomina "cromatografía líquida de alta presión".

Dependiendo del mecanismo de separación de sustancias, se distinguen las siguientes opciones de HPLC: adsorción, partición, intercambio iónico, exclusión por tamaño, quiral, etc.

En la cromatografía de adsorción, la separación de sustancias se produce debido a sus diferentes capacidades para adsorber y desorber de la superficie de un adsorbente con una superficie desarrollada, por ejemplo, gel de sílice.

En la HPLC de partición, la separación se produce debido a la diferencia en los coeficientes de distribución de las sustancias que se separan entre la fase estacionaria (normalmente injertada químicamente en la superficie de un soporte estacionario) y la fase móvil.

Según la polaridad, la HPLC PF y NP se dividen en fase normal y fase inversa.

La fase normal es una variante de la cromatografía que utiliza un sorbente polar (por ejemplo, gel de sílice o gel de sílice con grupos NH 2 o CN injertados) y un PF no polar (por ejemplo, hexano con varios aditivos). En la versión de cromatografía de fase inversa, se utilizan sorbentes no polares modificados químicamente (por ejemplo, radical alquilo no polar C 18) y fases móviles polares (por ejemplo, metanol, acetonitrilo).

En la cromatografía de intercambio iónico, las moléculas de una mezcla de sustancias, disociadas en solución en cationes y aniones, se separan cuando se mueven a través de un sorbente (intercambiador de cationes o intercambiador de aniones) debido a sus diferentes velocidades de intercambio con los grupos iónicos del sorbente.

En la cromatografía de exclusión por tamaño (tamiz, permeación en gel, filtración en gel), las moléculas de sustancias se separan por tamaño debido a su diferente capacidad para penetrar los poros de la fase estacionaria. En este caso, las moléculas más grandes (con mayor peso molecular) capaces de penetrar en el mínimo número de poros de la fase estacionaria son las primeras en salir de la columna, y las sustancias con tamaños moleculares pequeños son las últimas en salir.

A menudo, la separación no se produce a través de uno, sino a través de varios mecanismos simultáneamente.

El método HPLC se puede utilizar para controlar la calidad de cualquier analito no gaseoso. Para realizar el análisis se utilizan los instrumentos adecuados: cromatógrafos líquidos.

Un cromatógrafo líquido suele incluir los siguientes componentes principales:

– Unidad de preparación de PF, que incluye un contenedor con la fase móvil (o contenedores con solventes individuales incluidos en la fase móvil) y un sistema de desgasificación de PF;

– sistema de bombeo;

– mezclador de fase móvil (si es necesario);

– sistema de introducción de muestras (inyector);

– columna cromatográfica (se puede instalar en un termostato);

– detector;

– sistema de recogida y procesamiento de datos.

sistema de bombeo

Las bombas suministran PF a la columna a una velocidad constante determinada. La composición de la fase móvil puede ser constante o variar durante el análisis. En el primer caso, el proceso se denomina isocrático y, en el segundo, gradiente. A veces se instalan filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm delante del sistema de bombeo para filtrar la fase móvil. Un sistema de bombeo de cromatógrafo de líquidos moderno consta de una o más bombas controladas por computadora. Esto le permite cambiar la composición del PF según un programa específico durante la elución del gradiente. La mezcla de componentes de PF en un mezclador puede ocurrir tanto a baja presión (antes de las bombas) como a alta presión (después de las bombas). El mezclador se puede utilizar para preparar el PF y durante la elución isocrática; sin embargo, se logra una proporción más precisa de componentes mezclando previamente los componentes del PF para el proceso isocrático. Las bombas para HPLC analítica permiten mantener un caudal constante de PF en la columna en el rango de 0,1 a 10 ml/min a una presión en la entrada de la columna de hasta 50 MPa. Sin embargo, es aconsejable que este valor no supere los 20 MPa. Las pulsaciones de presión se minimizan mediante sistemas de amortiguación especiales incluidos en el diseño de las bombas. Las partes de trabajo de las bombas están hechas de materiales resistentes a la corrosión, lo que permite el uso de componentes agresivos en la composición del PF.

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Se desarrolló un método HPLC-MS/MS validado para identificar y cuantificar el nuevo derivado del aminoácido 1,3,4-tiadiazol LXT7-09. La máxima sensibilidad de la detección espectrométrica de masas del LHT7-09 se logró en el modo de detección de iones positivos con un voltaje de electropulverización de 5500 V y un potencial de desagrupación de 36 V. Se confirmaron las transiciones MRM identificadas. Estructura química un nuevo aminoácido derivado del 1,3,4-tiadiazol. Para aislar eficazmente LXT7-09 de mezclas multicomponentes de tiadiazolilamidas, se desarrolló un modo de gradiente de cromatografía líquida de alto rendimiento utilizando una mezcla de acetonitrilo y agua desionizada en diferentes proporciones como eluyente. Para estas condiciones cromatográficas, se determinó que el tiempo de retención del compuesto LHT7-09 era de 11 minutos. Para la determinación cuantitativa del compuesto LHT7-09, se desarrolló una solución de calibración para la dependencia del área del pico cromatográfico de la concentración de la solución.

HPLC-ms/ms

cromatografía

espectrometría de masas

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Estudio de la actividad antiinflamatoria de nuevos derivados de tiadiazol en el edema de pata inducido por formalina en ratas / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // Temas contemporaneos ciencia y educación. – 2013. – No. 3. www..

2. Nuevos derivados de tiadiazol con actividad antifúngica / A.S. Koshevenko [et al.] // Avances en micología médica. – 2015. – T. 14. – P. 348-351.

3. Síntesis y actividad antitumoral de nuevos 1,3,4-tiadiazoles, 1,2,4-triazoles / T.R. Hovsepyan [et al.] // Revista químico-farmacéutica. – 2011. – T. 45. – No. 12. – P. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Evaluación de la toxicidad aguda de un nuevo aminoácido derivado de tiadiazol cuando se administra por vía intraperitoneal a ratones / N.S. Popov, MA. Demidova // Revista médica del Alto Volga. – 2016. – T. 15, edición. 1. – págs.9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Evaluación de la ulcerogenicidad de un nuevo aminoácido derivado del tiadiazol cuando se administra por vía intragástrica a ratas / N.S. Popov, MA. Demidova // Estudiante de doctorado. – 2017. – N° 1(80). – págs. 71-78.

6. Síntesis y actividad antimicrobiana de amidas de ácidos feniltio y bencilsulfonilacéticos a base de 2-amino-5-alquil(arilalquil)-1,3,4-tiadiazoles / S.A. Serkov [et al.] // Revista químico-farmacéutica. – 2014. – T. 48, n.° 1. – P. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Síntesis y actividad farmacológica de derivados de imidazotiadiazol // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. vol. 73.No. 4. págs. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Síntesis y actividad anticancerígena del nuevo 1-tia-4-azaspirodecano, sus derivados tiazolopirimidina y tioglucósidos de 1,3,4-tiadiazol // moléculas. 2017. No. 22(1). Pág. 170.

9. Jorge R.A. Díaz, Gerardo Enrique Cami. Las sales de 5-amino-2-sulfonamida-1,3,4-tiadiazol, un estructural y análogo de la acetazolamida, muestran interesantes propiedades inhibidoras de la anhidrasa carbónica, acción diurética y anticonvulsiva // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. vol. 12.No. 6. págs. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Síntesis y actividad antifúngica de compuestos de 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinona a base de ácido deshidroabiético // Diversidad molecular. 2016. vol. 20.No. 4. págs. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Síntesis, evaluación biológica y estudio de modelado molecular de nuevos (1,2,4-triazol o 1,3,4-tiadiazol)-metiltio-derivados de quinazolin-4(3H)-ona como inhibidores de DHFR // Química Bioorgánica. 2017. vol. 72. págs. 282-292.

La cromatografía líquida de alta resolución con detección espectrométrica de masas es uno de los métodos más prometedores para la identificación y cuantificación de fármacos en diversos objetos biológicos. El método se caracteriza por una alta especificidad, precisión y capacidad para determinar sustancias en concentraciones mínimas, lo que permite su uso para la determinación cuantitativa de fármacos durante los estudios farmacocinéticos y la monitorización de fármacos, lo cual es importante para el diagnóstico de laboratorio clínico. Para ello, es necesario desarrollar y validar métodos para la determinación cuantitativa de diversas sustancias medicinales, incluidas las innovadoras, basados ​​en el método HPLC-MS/MS.

El fármaco original del grupo de los antiinflamatorios no esteroideos es la acexazolamida, un nuevo derivado de la 1,3,4-tiadiazolamida y el ácido acexámico. Una ventaja significativa de este compuesto es la baja toxicidad y la baja ulcerogenicidad. Para realizar estudios farmacocinéticos y evaluar la biodisponibilidad de este fármaco a través de diversas vías de administración, es necesario desarrollar un método confiable para su determinación cuantitativa en fluidos biológicos.

El propósito de este estudio fue el desarrollo de una técnica para la identificación y determinación cuantitativa de un nuevo fármaco antiinflamatorio no esteroideo del grupo de los derivados de tiadiazol mediante HPLC-MS/MS.

Materiales y métodos

El objeto del estudio fue un nuevo derivado del tiadiazol con el código de laboratorio LHT 7-09, sintetizado en OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) por el prof. S.Ya. Skáchilova (Fig.1).

2-(5-etil-1,3,4-tiadiazolil)amida ácido 2-acetilaminohexanoico

Arroz. 1. Estructura química de LHT 7-09 (fórmula bruta: C 12 H 20norte 4 o 2S; masa molar 284,4g/mol)

Conexión LHT 7-09 apariencia Es un polvo blanco prácticamente insoluble en agua, soluble en alcohol y fácilmente soluble en acetonitrilo.

Se utilizó un método validado de cromatografía líquida de alto rendimiento con detección espectrométrica de masas (HPLC-MS/MS) para identificar y cuantificar LCT 7-09.

La cromatografía se llevó a cabo utilizando un cromatógrafo líquido de alto rendimiento Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Alemania). En el estudio se utilizó una columna analítica Agilent Poroshell 120 EC-C18 de 2,7 µm y 2,1 x 10 mm. Para aislar el compuesto en estudio, desarrollamos un modo de cromatografía en gradiente. Como eluyentes se utilizaron acetonitrilo, agua desionizada y acetato de amonio en diversas proporciones.

Para la espectrometría de masas, se utilizó un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) con una fuente de iones por electropulverización (TurboV con sonda TurboIonSpray). El espectrómetro de masas se calibró usando una solución de prueba de reserpina a una concentración de 6,1 x 10 -2 mg/l.

El análisis espectrométrico de masas de las muestras estudiadas se realizó en modo electrospray con inyección directa de la muestra y el eluato suministrado por el cromatógrafo. La inyección directa de las muestras de prueba en el cromatógrafo de masas se realizó usando una bomba de jeringa con un diámetro de 4,61 mm a una velocidad de 10 µl/min.

Al desarrollar un método para identificar y cuantificar un nuevo derivado de tiadiazol, se seleccionaron las condiciones óptimas para la cromatografía líquida de alta resolución y la detección de masas. Se tuvo en cuenta el tiempo de liberación de la sustancia de la columna cromatográfica y la transición MRM (el registro se realizó metro/z ion precursor en el primer cuadrupolo analítico Q1 y metro/z iones producto en el segundo cuadrupolo analítico Q3). Para cuantificar LCT 7-09, se construyó un gráfico de calibración en el rango de concentración de 0,397 a 397 ng/ml.

Como software se utilizó el software AnalystMD 1.6.2. (ABSciex).

Resultados y discusión

En la primera etapa investigación experimental La detección masiva de la muestra de prueba se llevó a cabo introduciéndola directamente en el detector de masas usando una bomba de jeringa. En la etapa de preparación de la muestra, se preparó una solución de LHT 7-09 (500 ng/ml) en una mezcla de acetonitrilo y agua ionizada en una proporción de 2:1 con la adición de acetato de amonio (0,1%).

Los experimentos preliminares mostraron que en el modo de registro de iones positivos, la sensibilidad para determinar LHT 7-09 era mayor y el espectro de masas era más intenso e informativo que en el modo de registro de iones negativos. En este sentido, en estudios posteriores se utilizó únicamente el modo de ionización positiva.

Para obtener un pico intenso, se seleccionaron las siguientes condiciones de detección de masas: : polarización positiva, voltaje de electropulverización de 5500,0 V, potencial de desagrupación y potencial de inyección: 36,0 y 6,5 V, respectivamente, con una presión de gas de cortina de 20,0 psi y una presión de gas de atomización de 40,0 psi, velocidad de 10 μl/min. El rango de exploración fue de 270-300 Da.

El análisis del espectro de masas obtenido del primer cuadrupolo analítico Q1 mostró que en estas condiciones, debido a la adición de un protón de hidrógeno, se forma una molécula protonada del compuesto estudiado + con el valor metro/ z 285.2 Sí (Figura 2).

Arroz. 2. Espectro de masas de la molécula protonada LHT 7-09 (en modo de ion positivo + escaneo)

En el segundo cuadrupolo analítico Q3 se registraron los iones producto para el ion precursor con el valor m/z 285.2 Sí. El análisis del espectro de masas de segundo orden mostró la presencia de muchos picos, de los cuales 3 fueron los más intensos: m/z 114,2 días, m/z 130,2 Da y m/z 75,1 Da (Figura 3).

Arroz. 3. Espectro de masas de iones producto (en modo de escaneo de iones positivos, ion precursormetro/ z285.2 Sí)

Para obtener una señal de iones de alta intensidad, se seleccionaron los valores de energía óptimos en la celda de colisión Q2 (se consideró el rango de energía de 0 a 400 V). Para iones de producto con valores metro/ z 114,2 Da, 130,2 Da y 75,1 Da. La energía óptima en la celda de colisión fue de 27 V, respectivamente; 23 V y 49 V.

Se supone que el ion producto con el valor metro/ z 114,2 Da es un fragmento de 5-amino-2-etil-1,3,4-tiadiazol, ya que la fragmentación de otros derivados de 1,3,4-tiadiazol también revela un ion producto con el mismo valor. metro/ z. Ión de producto con significado. metro/ z 130,2 Da es probablemente una fracción protonada de ácido acexámico. Así, los resultados de la detección masiva de la muestra en estudio confirmaron la estructura química del nuevo derivado de 1,3,4-tiadiazol.

En la siguiente etapa del estudio experimental, el compuesto de prueba se analizó mediante espectrometría de masas HPLC.

En el modo HPLC-MS/MS, se utilizaron las siguientes condiciones de ionización: voltaje de electropulverización 5500,0 V, caudal de fase móvil 400 μL/min, temperatura del nitrógeno 400 °C, gas de cortina y presión de flujo de pulverización 20,0 y 50,0 psi, respectivamente. La velocidad de registro de espectros de masas individuales fue de 100 espectros por segundo. Para obtener el espectro de masas resumido, se seleccionó en el cromatograma un período de tiempo de 10,5 a 11,5 minutos; A partir de la intensidad de la señal de los iones producto, se construyeron curvas de la dependencia temporal de la corriente iónica y el área del pico de las señales individuales correspondientes al compuesto en estudio. El volumen de muestra introducido en la columna analítica fue de 10 µl.

Para aislar el compuesto en estudio se utilizó un modo gradiente de cromatografía líquida de alta resolución, que se aseguró cambiando la composición del eluyente en la entrada de la columna analítica. Como eluyentes se utilizaron acetonitrilo, agua desionizada y acetato de amonio en diversas proporciones. La elección del modo de cromatografía en gradiente se debió al hecho de que en las condiciones del modo de elución isocrática (incluso cuando se utilizan diferentes concentraciones de acetonitrilo), no fue posible obtener un pico de la sustancia problema de forma simétrica con un tiempo de retención. adecuado para el análisis. Según el estudio, el modo óptimo de suministro de eluyente fue: de 0 a 4 min, la concentración de acetonitrilo fue del 1%; de 4 a 8 minutos, un aumento lineal de la concentración de acetonitrilo hasta el 99%; de 8 a 12 minutos - sección isocrática (1% acetonitrilo). Al finalizar el estudio, la columna cromatográfica se lavó con una solución de acetonitrilo al 30% durante 5 minutos.

Cuando se utilizó el modo de cromatografía descrito, se obtuvo un pico simétrico de intensidad suficiente para el compuesto estudiado (Fig. 4).

Arroz. 4. Cromatograma LHT 7-09 (columna analíticaAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm; modo de cromatografía de gradiente)

El análisis de los cromatogramas obtenidos para soluciones LCT 7-09 de diferentes concentraciones mostró que el tiempo de retención (tR) en estas condiciones de elución fue de 11 minutos y no dependió de la concentración de la sustancia en estudio. En este sentido, el valor del tiempo de retención se puede utilizar como criterio adicional para confirmar la autenticidad de LHT 7-09 en mezclas multicomponentes. Cabe destacar el hecho de que estos parámetros cromatográficos se pueden utilizar para identificar LHT 7-09 no solo utilizando un detector de masas, sino también otros detectores, incluidos los fotométricos.

Para cuantificar el nuevo derivado de tiadiazol se construyó un gráfico de calibración en el rango de concentración de 0,397 ng/ml a 397 ng/ml (Fig. 5).

Arroz. 5. Gráfico de calibración para determinar la concentración de LCT 7-09 (a lo largo del eje de abscisas está la concentración de LCT 7-09 en ng/ml, a lo largo del eje de ordenadas está el área del pico en pulsos)

Para desarrollar una solución de calibración se utilizaron soluciones de LHT 7-09 en concentraciones de 0,397; 1.980; 3.970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. La dependencia del área del pico de la concentración del compuesto estudiado se describió mediante la siguiente ecuación de regresión:

y= 8.9e 5 ·x 0.499, el valor del coeficiente de regresión fue r=0.9936.

Cabe señalar que la solución de calibración desarrollada permite una determinación cuantitativa de alta precisión del compuesto estudiado en una amplia gama de concentraciones, lo que permite utilizar este método para evaluar la calidad de una sustancia medicinal y realizar estudios farmacocinéticos.

Así, el resultado del estudio fue el desarrollo de un método para la identificación y cuantificación de un nuevo aminoácido derivado del tiadiazol mediante HPLC-MS/MS.

conclusiones

1. HPLC-MS/MS permite la identificación y cuantificación de un nuevo aminoácido derivado de tiadiazol con alta precisión.
2. La detección masiva del nuevo derivado de tiadiazol LHT 7-09 debe realizarse en el modo de escaneo de iones positivos (transición MRM - ion precursor Q1 metro/ z 285,2 Sí; iones producto Q3 metro/ z 114,2 días, metro/ z 130,2 Da y metro/ z 75,1 Da).
3. Para aislar LCT 7-09 a partir de mezclas multicomponentes se ha desarrollado una técnica de cromatografía líquida de alta resolución (columna analítica Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; eluyente acetonitrilo: agua desionizada: acetato de amonio; modo gradiente).

Enlace bibliográfico

Popov N.S., Malygin A.S., Demidova M.A. DESARROLLO DEL MÉTODO HPLC-MS/MS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE UN NUEVO DERIVADO DE TIADIAZOL // Problemas modernos de la ciencia y la educación. – 2017. – nº 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (fecha de acceso: 01/02/2020). Llamamos su atención sobre las revistas publicadas por la editorial "Academia de Ciencias Naturales".