Tillämpning av tandemmasspektrometri (HLC-MSMS) i klinisk diagnostik. Tillämpning av tandemmasspektrometri (HLC-MSMS) i klinisk diagnostik Material och metoder

Nyckelord

STEROIDER / LIPIDER / BLODSERUM / METABOLISK PROFIL / INDUSTRIAVFALL/ STEROIDER / LIPIDER / BLODSERUM / METABOLISK PROFIL / INDUSTRIAVFALL

anteckning vetenskaplig artikel om veterinärvetenskap, författare till vetenskapligt arbete - Chakhovskiy Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

Inverkan av antropogena faktorer har en mångfacetterad effekt på människokroppen och djuren. I samband med deras komplexa inverkan är det en ganska svår uppgift att identifiera de negativa effekterna av enskilda faktorer. Den metabolomiska metodiken, som gör det möjligt att övervinna dessa svårigheter, användes för att bedöma arten och omfattningen av effekten av avfall från produktion av kaliumgödsel på lipidprofilerna hos försöksdjur under intranasal sådd med avfall från produktion av kaliumgödsel. och konsumtionen av dricksvatten som erhållits från källor belägna i området för potentiell påverkan av kaliumproduktion. Isoleringen av lipider från serum utfördes med en specialutvecklad teknik baserad på fastfasextraktion, vilket gör det möjligt att ta bort kolesterol från prover. Varje prov analyserades med högpresterande vätskekromatografi med masspektrometrisk detektion (HPLC-MS), varefter de resulterande kromatogrammen bearbetades med metoden för huvudkomponenter (PCA) och klusteranalys. Den utvecklade tekniken gör det möjligt att effektivt separera hydrofoba metaboliter i blodserum. Lipidprofilen för blodserum från försöksdjur, i synnerhet innehållet av fosfolipider och oxysteroider, fastställdes och skillnader i metaboliska processer mellan försöksdjur och kontrolldjur hittades. I blodserumet från försöksdjur ökade koncentrationen av oxysteroider jämfört med kontrollgruppen.

Relaterade ämnen vetenskapliga artiklar inom veterinärvetenskap, författaren till vetenskapligt arbete - Chakhovskiy Pavel Anatolyevich, Yantsevich Alexey Viktorovich, Dmitrochenko Alesya Egorovna, Ivanchik Alexander Viktorovich

• Responsen från organeller från råttleverhepatocyter på påverkan av ett amplitudmodulerat magnetfält med industriell frekvens

  2014 / Belkin Anatoly Dmitrievich, Michurina Svetlana Viktorovna

• Massselektiv identifiering av hormonpreparat i rått kött. Analys av ß-agonister

  2016 / Kulikovsky A.V., Kuznetsova O.A., Ivankin A.N.

• Användningen av högpresterande vätskekromatografi för bestämning av ubikinon i vattenlevande organismer

  2003 / Rybin V. G.

• Bestämning av N7--etyl]-guanin i urinen hos råttor som en markör för exponering för svavelsenap

  2017 / Orlova Olga Igorevna, Karakashev Georgy Vasilyevich, Shmurak Vladimir Igorevich, Abzianidze Victoria Vladimirovna, Savelyeva Elena Igorevna

• Utveckling av en HPLC-MS-metod för analys av ursodeoxicholsyra i sättet att detektera positivt laddade joner

  2013 / Ilya Aleksandrovich Krasnov, D. E. Bobkov, M. Zaitseva, S. S. Prisyach, N. V. Krasnov

• Utveckling av teknologi för att skapa ny generation testsystem baserade på trombodefensiner för expressdiagnostik av infektions- och inflammatoriska sjukdomar

  2015 / Ivanov Yury Borisovich, Vasilchenko Alexey Sergeevich

• Procedur för samtidig bestämning av karbamazepin och karbamazepin-10,11-epoxid med HPLC-MS/MS

  2015 / Rodina T.A., Melnikov E.S., Sokolov A.V., Prokofiev A.B., Arkhipov V.V., Adamov G.V., Pozdnyakov D.L., Olefir Yu.V.

• Sammansättning av fettsyror och steroider av vegetabiliska oljor

  2006 / Khasanov V. V., Ryzhova G. L., Dychko K. A., Kuryaeva T. T.

• Utveckling och validering av en metod för bestämning av gidazepam i biologiskt material genom kromatomasspektrometri

  2015 / A.V. Chubenko, M.A. Savchenko

• Bestämning av ciklosporin a i blodserum för terapeutisk läkemedelsövervakning

  2008 / Fedorova G. A., Podolskaya E. P., Novikov A. V., Lyutvinsky Ya. I., Krasnov N. V.

ANALYS AV SERUMLIPIDPROFILER HOS MARSvin FÖR TIDIGT DETEKTION AV ÄNDRINGAR I METABOLISMEN UNDER EXPONERING FÖR MILJÖFÖRENINGEN

Exponeringen för antropogena faktorer har en mångfacetterad inverkan på kroppen hos människor och djur. På grund av deras komplexa inflytande är upptäckten av negativa effekter av vissa faktorer en ganska komplicerad uppgift. Metabolomisk metod som gör det möjligt att övervinna dessa svårigheter har tillämpats vid utvärderingen av arten och graden av inverkan av avfall från produktion av kaliumgödselmedel på lipidprofiler hos försöksdjur efter intranasal ympning med avfall från produktion av kaliumgödsel och konsumtion av dricksvatten från källor belägen i området för potentiell verkan av produktion av kaliumgödsel. Isolering av lipider från serum utfördes med hjälp av specialutvecklad teknik baserad på fastfasextraktion av prover som gör det möjligt att avlägsna kolesterin från proverna. Varje prov utsattes för HPLC-MS-analys, varefter de erhållna kromatogrammen behandlades med användning av metoden för huvudkomponentanalys och klusteranalys. Den utvecklade tekniken gör det möjligt att effektivt separera hydrofoba metaboliter i blodserum. Det fanns en etablerad serumlipidprofil hos försöksdjur, särskilt innehållet av fosfolipider och oxisteroider, och det fanns skillnader i metaboliska processer hos test- och kontrolldjuren. Det har visat sig att i serum från försöksdjur observeras en ökad koncentration av hydroxisteroid jämfört med kontrollgruppen.

Texten till det vetenskapliga arbetet på ämnet "WLC-MS-metod för analys av lipidprofiler av blodserum från marsvin för att upptäcka tidiga förändringar i metabolism när de utsätts för miljöföroreningar"

[hyena och sanitet 3/2014

Chakhovskiy P.A.1, Yantsevich A.V.2, Dmitrochenko A.E.2, Ivanchik A.V.2

HPLC-MS-METOD FÖR ANALYS AV LIPIDPROFILER AV BLODSERUM

marsvin för att upptäcka tidiga metaboliska förändringar när de utsätts för föroreningar miljö

TU "Republican Scientific and Practical Centre for Hygiene", 220012, Minsk, Republiken Vitryssland; ^Institutet för bioorganisk kemi vid National Academy of Sciences of Vitryssland, 220141, Minsk, Republiken Vitryssland

Inverkan av antropogena faktorer har en mångfacetterad effekt på människokroppen och djuren. I samband med deras komplexa inverkan är det en ganska svår uppgift att identifiera de negativa effekterna av enskilda faktorer. Den metabolomiska metodiken, som gör det möjligt att övervinna dessa svårigheter, användes för att bedöma arten och omfattningen av effekten av avfall från produktion av kaliumgödsel på lipidprofilerna hos försöksdjur under intranasal sådd med avfall från produktion av kaliumgödsel. och konsumtionen av dricksvatten som erhållits från källor belägna i området för potentiell verkan av kaliumproduktion. Isoleringen av lipider från serum utfördes med en specialutvecklad teknik baserad på fastfasextraktion, som gör det möjligt att ta bort kolesterol från prover. Varje prov analyserades med högpresterande vätskekromatografi med masspektrometrisk detektion (HPLC-MS), varefter de resulterande kromatogrammen bearbetades med metoden för huvudkomponenter (PCA) och klusteranalys. Den utvecklade tekniken gör det möjligt att effektivt separera hydrofoba metaboliter i blodserum. Lipidprofilen för blodserum från försöksdjur, i synnerhet innehållet av fosfolipider och oxisteroider, fastställdes och skillnader i metaboliska processer mellan försöksdjur och kontrolldjur hittades. I blodserumet från försöksdjur ökade koncentrationen av oxysteroider jämfört med kontrollgruppen.

Nyckelord: steroider; lipider; blodserum; metabolisk profil; industriavfall.

P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 - ANALYS AV SERUMLIPIDPROFILER HOS MARSvin FÖR TIDIGT DETEKTION AV ÄNDRINGAR I METABOLISMEN UNDER EXPONERING FÖR FÖREBYGGANDE MILJÖ

1The Republican Scientific and Practical Center of Hygiene, Minsk, Republiken Vitryssland, 220012; 2Institutet för bioorganisk kemi, Minsk, Republiken Vitryssland, 220141

För korrespondens: Chakhovskiy Pavel Anatolyevich, [e-postskyddad]. com

Exponeringen för antropogena faktorer har en mångfacetterad inverkan på kroppen hos människor och djur. På grund av deras komplexa inflytande är upptäckten av negativa effekter av vissa faktorer en ganska komplicerad uppgift. Metabolomisk metod som gör det möjligt att övervinna dessa svårigheter har använts vid utvärderingen av arten och graden av påverkan av avfall från produktion av kaliumgödselmedel på lipidprofiler hos försöksdjur efter intranasal ympning med avfall från produktion av kaliumgödsel och konsumtion av dricksvatten som erhållits från lokaliserade källor i området för potentiell verkan av produktion av kaliumgödsel. Isolering av lipider från serum utfördes med hjälp av en specialutvecklad teknik baserad på fastfasextraktion av prover som gör det möjligt att avlägsna kolesterin från proverna. Varje prov utsattes för HPLC-MS-analys, varefter de erhållna kromatogrammen behandlades med användning av metoden för huvudkomponentanalys och klusteranalys. Den utvecklade tekniken gör det möjligt att effektivt separera hydrofoba metaboliter i blodserum. Det fanns en etablerad serumlipidprofil hos försöksdjur, särskilt innehållet av fosfolipider och oxisteroider, och det fanns skillnader i metaboliska processer hos test- och kontrolldjuren. Det har visat sig att i serum från försöksdjur observeras en ökad koncentration av hydroxisteroid jämfört med kontrollgruppen.

Nyckelord: steroider, lipider, blodserum, metabolisk profil, industriavfall.

Introduktion

En av de viktigaste uppgifterna för systembiologi och funktionell genetik är integrationen av proteomik, transkriptomik och information om metaboliska processer som förekommer i kroppen. Varje sjukdom eller patologisk process som inträffar i kroppen återspeglas i innehållet av lågmolekylära metaboliter i vävnader och blod. 1971 introducerades termen "metabolisk profil" för den integrerade karakteriseringen av metaboliter med låg molekylvikt av blodplasma. Eftersom den samtidiga analysen av flera klasser av metaboliter är extremt svår och praktiskt taget orealistisk, används ofta en rad metoder för att studera metaboliska profiler, inklusive högupplöst kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och kromato-masspektrometri.

Som regel är metabolomiska studier begränsade till en viss grupp av ämnen som separeras från andra komponenter under provberedningen. De resulterande gruppdata är lättare att tolka.

Metaboliska profiler (särskilt urin och blodplasma) kan användas för att bestämma arten av fysiologiska förändringar orsakade av intag av giftiga föreningar i kroppen. I många fall kan de observerade förändringarna ge ytterligare karakterisering av specifika lesioner, såsom lever och fettvävnad.

Analysen av innehållet av steroider och lipider i blodserumet har en stor diagnostisk potential. Lipidsammansättningen av blodserum, steroidhormoner, deras prekursorer och produkter av deras metaboliska transformationer kännetecknar många funktionella parametrar i kroppen. Dessa ämnen spelar en viktig koordinerande roll i regleringen av ämnesomsättning och kardiovaskulär funktion, och är involverade i kroppens svar på akut och kronisk stress.

Steroidprofilen är ett unikt diagnostiskt kriterium för ett antal gynekologiska och onkologiska sjukdomar förknippade med nedsatt syntes och metabolism av steroidhormoner, medan vissa av dem endast kan diagnostiseras av steroidprofilen. I profilanalys är möjligheten att använda absoluta värden som enkla variabler och jämföra dem med normen mycket betydande. Det kan dock vara viktigare att ändra storleksförhållandet. Dessutom ger steroidprofilen information om ett stort antal steroider samtidigt.

Bestämning av steroidprofilen för blodserum - effektiv metod upptäckt av nästan alla störningar av steroidmetabolism, vilket gör att du kan sätta

noggrann diagnos i många kliniska situationer, till exempel vid medfödd binjurehyperplasi, typ I hyperaldosteronism, primär hyperaldosteronism, Itsenko-Cushings sjukdom, binjurebarksvikt, etc. Steroidprofilen är viktig vid diagnos av störningar i sexuell differentiering och funktion hos gonaderna , samt hypotalamus hypofys-binjurebar insufficiens.

Överdrivet intag av salt, som är den dominerande komponenten av kaliumgödselavfall, i kroppen hos överviktiga experimentråttor leder till överdriven aktivering av aldosteronsyntesen och orsakar hypertoni och njurskador med metabolt syndrom.

I regionerna för industriproduktion med en hög grad förorening av miljön är befolkningens sjuklighet vanligtvis högre än i relativt "rena" regioner. Målet för vår forskning var staden Soligorsk, belägen i zonen för storskalig brytning och bearbetning av kalimalmer. I områden med saltdeponier och slamlagringar av kaliumklorid har en zon med natriumkloridförsaltning bildats, som täcker grundvatten till ett djup av mer än 100 m, vilket kan påverka föroreningen av dricksvattenförsörjningskällor och atmosfärisk luft.

För att bedöma effekten av föroreningar av enskilda miljökomponenter i regionen för industriell produktion av kaliumgödsel, analyserade vi blodserumets lipidprofiler som en indikator på tidiga metabola störningar under påverkan av en blandning av kemikalier.

Syftet med arbetet är att identifiera metabola förändringar hos laboratoriedjur vid exponering för kaliumkloridproduktionsavfall och konsumtion av dricksvatten från källor som potentiellt påverkas av produktionsavfall med hjälp av högpresterande vätskekromatografi med masspektrometrisk detektion (HPLC-MS).

Syftet med studien var blodserum från försöksdjur (marsvin) från försöks- och kontrollgrupperna.

Material och metoder

Experimentella studier utfördes på 35 marsvin (17 honor och 18 hanar) som vägde 305-347 g.

[hyena och sanitet 3/2014

Experimentgrupp (utsäde med avfall från industriell produktion av kaliumgödsel och dricksvatten från vattenförsörjningssystemet i staden Soligorsk), 20 individer (10 kvinnor och 10 män);

Kontrollgrupp (priming med isoton natriumkloridlösning för att eliminera effekterna av stressfaktorn som orsakas av primingproceduren), 15 individer (8 män och 7 honor).

Under experimentet observerade dagligen djurens allmänna tillstånd, konsumtion av foder och vatten.

För att simulera kronisk exponering vid inandning (12 veckor) av avfall från produktion av kaliumgödsel, MU. Nr 11-11-10-2002 "Krav på organisering av toxikologiska och allergologiska studier under hygienisk reglering av proteinhaltiga aerosoler i luften av arbetsområdet", inklusive bestämning av frödosen, användes. Prover från saltdeponier maldes i en marmormortel till ett homogent dammigt tillstånd, löstes i destillerat vatten till den erforderliga koncentrationen, med hänsyn tagen till försöksdjurens kroppsvikt (kroppsvikten övervakades varje vecka för att justera dosen). De beräknade doserna var: i början av experimentet - 2,028 mg / 0,1 cm3, efter 4 veckor - 2,85 mg / 0,1 cm3, efter 6 veckor - 3,17 mg / 0,1 cm3, efter 8 veckor och fram till slutet av experimentet 3,8 mg/0,1 cm3.

Ett marsvin utan bedövning fixerades i ryggläge med höjt huvud, en dos av en varm lösning injicerades växelvis i näsborrarna (fraktionellt) (inom 2-3 minuter) med en pipettdispenser på ett sådant sätt att nysningar uteslöts. . De resulterande "squishing" ljuden bekräftade penetrationen av lösningen i luftvägarna.

Den experimentella gruppen av djur "inhalerade" blandningen dagligen en gång 5 dagar i veckan under 12 veckor. Djur från kontrollgruppen "inhalerade" fysiologisk koksaltlösning (0,9% NaCl).

För urval av biologiskt material bedövades djuren (eterbedövning), efter halshuggning samlades blod. Serum erhölls genom centrifugering vid 3000 rpm under 15 minuter, lagrades vid -20 C för ytterligare studier. Fosfolipider, oxysteroider och fettsyror analyserades i blodserumet.

Provberedning. En intern standard, progesteron, sattes till blodserum tills en koncentration av 10–5 M uppnåddes (10 μl per 1 ml prov). Sedan, för att fälla ut proteiner som ingår i provet och extrahera steroider, tillsattes metanol till en slutlig koncentration av 70 % (2,33 ml metanol per 1 ml prov), följt av centrifugering i 15 minuter vid 10 000 g. Proteinerna i provet bildade en tät fällning. Supernatanten separerades från pelleten och fick passera genom en förkonditionerad fastfasextraktionskolonn (SPE) innehållande 100 mg oktadecylsilylsilikagel. SFE-kolonnen konditionerades genom att sekventiellt passera 2 ml metanol, 2 ml vatten och 2 ml 70% metanol. I det första steget binds kolesterol till kolonnen, vars innehåll i blodplasma och andra biologiska vätskor är ganska högt, liksom ett antal andra mycket hydrofoba lipider. Efter kolesterolbindning tvättades kolonnen ytterligare med 2 ml 70% metanol. Med en hög kolesterolhalt i provet eller en stor volym av provet, använd

använde en TFE-kolonn med hög halt av sorbent. Eluaten kombinerades och indunstades. Indunstning utfördes vid 50°C i en inertgasstråle. Den torra återstoden löstes i 500 ul metanol och centrifugerades i 10 minuter vid 10 000 g. I detta fall utfälldes polära, metanololösliga föreningar. Supernananten separerades från fällningen och späddes med vatten till en metanolkoncentration av 10 %. Den resulterande lösningen fick passera genom en förkonditionerad TFE-kolonn (2 ml metanol, 2 ml vatten och 2 ml 10% metanol fick passera) och tvättades med 2 ml 10% metanol. Steroider bundna till kolonnen eluerades med 3 ml 80% metanol. Lösningen indunstades och den torra återstoden löstes i 100 μl metanol. Den resulterande lösningen analyserades med användning av HPLC-MS.

HPLC-analys. Analysen utfördes på en Accela-kromatograf utrustad med en LCQ-Fleet masspektrometrisk detektor. Separation utfördes på en Cosmosil 5C18-MS-II-kolonn med geometriska parametrar på 4,6*150 mm (Nacalai Tesque, Japan).

Separationsprogram (lösningsmedel A - vatten, lösningsmedel B - metanol, flödeshastighet 500 μl / min): i 5 min 60% B, 12 min - linjär gradient 60-95% B, 10 min - 95% B, 8 min - linjär gradient 95-100% B, 5 min - 100% B, 5 min - 60% B.

För masspektrometrianalys användes en källa för kemisk jonisering vid atmosfärstryck (APCI). Parametrar för joniseringskälla: förångartemperatur - 350°C, torkgasflöde - 35 enheter, hjälpgasflöde - 5 enheter, kapillärtemperatur - 275°C, kapillärspänning - 18 V, spänning på jonobjektivet - 80 V. Använd data- beroende avsökningsläge (Data Dependent™) med en jonfälla i skanningsområdet 50-1000 m/z.

Kromatogram erhållna med en masspektrometrisk detektor i kemisk joniseringsläge (total jonström) omvandlades till textformat med hjälp av programmet Qual Browser från Xcalibur-paketet (Thermo Sci, USA). Den erhållna informationen bearbetades med hjälp av den principiella komponentmetoden implementerad i Statistica 10-paketet och verktyg för klusteranalys och konstruktion av dendrogram. En handbok användes för att tolka masspektra och identifiera enskilda föreningar.

resultat och diskussion

Som en första metod för anpassning användes metoden för fastfasextraktion av steroider från serum och blodplasma, beskriven i manualen för företaget "Macherey-Nagel" Fastfasextraktion. Applikationsguide, som innehåller rekommendationer för användning av SPE-kolumner. Den anpassade provberedningstekniken med fastfasextraktion gjorde det möjligt att effektivt isolera fosfolipider, hydroxisteroider och fettsyror från blodserum från marsvin.

Den beskrivna kromatografiska separationstekniken gör det möjligt att effektivt separera både steroidhormoner och serumlipider.

Prover analyserades enligt de beskrivna metoderna. På fig. 1 (se 2:a försättsbladet) för ett exempel visas överlagrade kromatogram erhållna från analysen av 3 prover från experimentgruppen (markerade

Ris. Fig. 4. Massspektra för ämnet med en retentionstid på 21,5 min: a - kemisk jonisering vid atmosfärstryck i negativt läge; b - kemisk jonisering vid atmosfärstryck i positivt läge.

i rött) och 3 prover från kontrollgruppen (markerade i blått). Ett liknande mönster observerades i andra fall.

För att bearbeta dessa datamatriser användes principal component method (PCA) och klusteranalys, vilket gjorde det möjligt att identifiera skillnader i lipidprofiler mellan kontroll- och experimentgruppen. PCA-plott av de erhållna 1:a och 2:a huvudkomponenterna

när datadimensionen reduceras, visas i fig. 2 (se 2:a försättsbladet). På grafen är det lätt att se att punkterna är kombinerade i 2 grupper, placerade i 1:a, 4:e respektive 2:a, 3:e kvadranten. I det här fallet faller de punkter som motsvarar de experimentella proverna huvudsakligen i 1:a och 4:e kvadranten, de punkter som motsvarar kontrollproverna är lokaliserade i 2:a och 3:e kvadranten. Dendrogrammet erhållet med

[hyena och sanitet 3/2014

Identifiering av toppar som finns i kromatogrammet

Retentionstid, min Huvudtoppar i "+"-läge Huvudtoppar i "-"-läge

19,15 393,7 446,8

448,7 493,5 623,4 524,4

19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4

21,50 316,1 390,0

430.3 448.4 779,1

23,8 319.4 391,6 429.5 783,2

24,35 414,8 448,8

31,73 313,3 330,9

33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4

Ämne

Fosfatidylkolin

Arakinsyra

Fosfatsyra 42:4

Arachinsyra och dokosat-traensyra

Dokosapentaenoisk

Linolsyra

Dihydroxikolesterol

akteranalys visas i fig. 3. Den statistiska analysen av kromatografiska data indikerar således skillnaderna i de metaboliska processer som förekommer i organismerna hos försöksdjur som tillhör kontroll- och försöksgrupperna.

För att identifiera specifika metaboliska förändringar dechiffrerades och identifierades masspektra

individuella föreningar citeras (se tabell). Otillräcklig provvolym för analys gjorde det inte möjligt att detektera förändringar i profilen av steroidhormoner i serum. Emellertid detekterades lipider med mellanliggande polaritet på kromatogrammet.

Individuella föreningar identifierades genom att analysera masspektra av substanser registrerade under olika joniseringssätt. Sålunda visas masspektrumet för ett ämne i två joniseringslägen med en retentionstid på 21,5 min i fig. 4. Analys av detta spektrum visade att ämnet är diacyl-sn-glycerofosfat med molekylvikt 780 (R1(311) = 20:0 fettsyra (arakidin), R2(331) = 22:4 fettsyra (dokosatetraensyra)).

Man fann att den kromatografiska toppen med en retentionstid på 42,52 min motsvarar dihydroxikolesterol, förmodligen en av prekursorerna i biosyntesen av gallsyror. Skillnader i innehållet av oxysteroider i blodserumet indikerar en möjlig kränkning av metabolismen av gallsyror. Det kan ses att kromatogrammen som visas i fig. 1, i blodserumet från försöksdjur finns en ökad koncentration av oxysteroider jämfört med kontrollen (toppar med en retentionstid på 35-45 min).

slutsats. Tekniken som används i arbetet gör det möjligt att tidigt upptäcka störningar i lipidmetabolismen med hög effektivitet under påverkan av miljöföroreningar. De erhållna resultaten indikerar att intranasal administrering av vattenlösningar av saltdeponier till försöksdjur Cavia porcellus leder till en förändring i metabolismen av lipider och oxisteroider. I synnerhet kan det observerade förhöjda innehållet av gallsyraprekursorer (hydroxisteroider) hos djur vara associerat med nedsatt leverfunktion och enzymer involverade i biosyntesen av gallsyror. Således kan det beskrivna tillvägagångssättet användas för att upptäcka lipidmetabolismstörningar hos invånare i regioner med teknogen förorening.

Litteratur

1. Horning E.C., Horning M.G. Metaboliska profiler: gasfasmetoder för analys av metaboliter. Clin. Chem. 1971; 17(8): 802-9.

2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Tillämpning av NMR-baserad metabonomik vid undersökning av myokardischemi-reperfusion, ischemisk prekonditionering och antioxidantintervention i rabbits. Eur. J Pharm. sci. 2007; 30(3-4): 303-14.

3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analytiska strategier för LC-MS-baserad målinriktad metabolomik. J Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. livsvetenskap. 2008; 871(2): 236-42.

4. Novotny M.V, Soini H.A., Mechref Y. Bioindividuell kemi återspeglas i kromatografiska, elektroforetiska och masspektrometriska profiler. J Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. livsvetenskap. 2008; 866(1-2): 26-47.

5. Tyska J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidomics och lipidprofilering i metabolomics. Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18(1): 66-71.

6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Användning av steroidprofilering av UPLC-MS/MS som ett andra steg vid screening av nyfödda för medfödd binjurehyperplasi: Utah-upplevelsen. Pediatr. Res. 2009; 66(2): 230-5.

7. Rauh M. Steroidmätning med LC-MS/MS. Ansökan

Till Art. Chakhovsky et al.

Ris. 3. Dendrogram konstruerat på basis av klusteranalys och illustrerar klustringen av prover i grupper.

Till Art. Chakhovsky et al.

Ris. 1. Överlappande kromatogram av prov 1-3 från kontrollgruppen (markerade i rött) och 15-17 från experimentgruppen (markerade i blått).

Projektion av fallen på faktorplanet (1 x 2) Fall med summan av cosinuskvadrat >= 0,00

18/3 9/z 21/1 ■ O

1 lån "Sh ca 28/1" 22/10 41 /1 sid

Faktor 1: 65,71 %

Ris. 2. Graf erhållen genom att bearbeta kromatogram med PCA. Kontrollgruppen är markerad i blått, experimentgruppen i rött.

Enligt en recension publicerad i Clinical Biochemist Reviews har användningen av högpresterande vätskekromatografi i kombination med tandemmasspektrometri (HPLC-MS/MS) i kliniska laboratorier ökat enormt under de senaste 10-12 åren. Författarna noterar att specificiteten för HPLC-MS/MS-analys är betydligt överlägsen immunologiska metoder och klassisk högpresterande vätskekromatografi (HPLC) vid analys av lågmolekylära molekyler och har en betydligt högre genomströmning än gaskromatografi-masspektrometri ( GC-MS). Denna metods popularitet i rutinmässiga kliniska analyser förklaras för närvarande av metodens unika kapacitet.

De främsta fördelarna med HPLC-MS/MS-metoden är:
• Förmåga att noggrant kvantifiera små molekyler;
• Samtidig analys av flera målföreningar;
• Unik specificitet;
• Hög analyshastighet.

V senaste åren stor uppmärksamhet ägnas åt analystiden och, som ett resultat, till att öka laboratoriets produktivitet. En signifikant minskning av analystiden möjliggjordes genom användningen av korta analytiska kolonner för HPLC/MS/MS, samtidigt som analysens specificitet ökade dramatiskt. Användningen av atmosfärisk tryckjonisering (API), tandem trippel kvadrupol masspektrometer och avancerad högpresterande vätskekromatografi och relaterade provberedningsmetoder har fört LC/MS/MS i framkant av moderna analysmetoder för klinisk forskning.

De huvudsakliga tillämpningsområdena för HPLC/MS/MS i klinisk medicin:
• Att erhålla en fullständig profil av metabolismen av steroider (steroidpaneler), puriner och pyrimidiner och andra föreningar,
  screening av nyfödda för medfödda metabola fel (detektering av flera dussin sjukdomar i en analys);
• Terapeutisk övervakning av läkemedel - immunsuppressiva medel, antikonvulsiva medel, antiretrovirala medel, antikoagulantia och alla andra - oavsett tillgängligheten av tillverkarens kit. Du behöver inte köpa dyra kit för varje ämne - du kan utveckla dina egna metoder;
• Klinisk toxikologi - analys av mer än 500 narkotiska föreningar och deras metaboliter i en analys, utan bekräftande analys
  proteomik och metabolomik.

Dessutom används HPLC-MSMS för att screena för oligosackarider i urinen, sulfatid, långkedjiga fettsyror, långkedjiga gallsyror, metylmalonsyra, studera porfyrier, screena patienter med störningar i purin- och pyrimidinmetabolismen.

Tillämpningsexempel på vätskekromatografi
i kombination med tandemmasspektrometri i kliniska analyser.

Nyföddscreening: Det första exemplet på masstillämpning av HPLC-MS/MS i klinisk diagnostik var screening av medfödda metabola fel hos nyfödda. Det är nu rutinmässigt i utvecklade länder och omfattar mer än 30 olika sjukdomar, inklusive acemi, aminoacidopatier, defekter i fettsyraoxidation. Särskilt anmärkningsvärt är forskning om fosterskador, som kan leda till allvarliga problem om de inte åtgärdas omedelbart (t.ex. ett förstorat hjärta eller lever, eller hjärnödem). Fördelen med att använda HPLC-MS/MS för neonatal screening är möjligheten att samtidigt analysera alla aminosyror och acylkarnitiner i en snabb, billig och mycket specifik metod.

Terapeutisk läkemedelsövervakning: Utvecklingen och introduktionen av det immunsuppressiva medlet sirolimus (rapamycin) för att förhindra organavstötning efter transplantation har varit en av de främsta drivkrafterna för införandet av HPLC-MS/MS i kliniska laboratorier. Den moderna HPLC-MS/MS-metoden möjliggör samtidig bestämning av takrolimus, sirolimus, cyklosporin, everolimus och mykofensyra.

HPLC-MS/MS används också för analys av cytotoxiska, antiretrovirala läkemedel, tricykliska antidepressiva medel, antikonvulsiva medel och andra läkemedel som kräver individuell dosering.

HPLC-MSMS-metoden gör det möjligt att separera och kvantifiera R- och S-enantiomererna av warfarin i koncentrationsintervallet 0,1-500 ng/ml.

Droger och smärtstillande medel: HPLC-MS/MS används ofta för analys av dessa föreningar på grund av den enkla provberedningen och korta analystider. Metoden används för närvarande i kliniska laboratorier för att screena för förekomsten av ett brett spektrum av läkemedel. Metodens unika specificitet och känslighet gör det möjligt att samtidigt analysera mer än 500 föreningar av olika klasser i ett prov med minimal provberedning. Så, i fallet med urinanalys, räcker det med en enkel utspädning av provet med 50-100 gånger. När man analyserar hår, istället för ett gäng med 100-200 hårstrån, räcker ett enda hårstrå för att på ett tillförlitligt sätt identifiera fakta om droganvändning.

Endokrinologi och steroidanalys: HPLC-MS/MS används flitigt i många endokrinologiska laboratorier för analys av steroider - testosteron, kortisol, aldesteron, progesteron, östriol och många andra.

Fler och fler laboratorier börjar använda HPLC-MS/MS för att fastställa blodnivåer av vitamin D3 och D2.

I. Definition av steroider (steroidprofil).

Laboratorier på sjukhus och kliniker har nu möjlighet att utföra samtidig bestämning av flera steroider med hjälp av HPLC/MS/MS. Det finns inget behov av en stor provvolym, vilket är särskilt viktigt när man analyserar barns prover.

Fall där det är tillrådligt att utföra bestämning av flera (profilerande) steroider:
• Medfödd binjurehyperplasi (CAH) är en medfödd defekt i steroidbiosyntesen. Detta är en ärftlig grupp av sjukdomar som orsakas av felaktig aktivitet av binjurebarkenzymer, vilket leder till en minskning av produktionen av kortisol. För en tillförlitlig diagnos av SAN rekommenderas det att fastställa kortisol, androstenedion och 17-hydroxiprogesteron. HPLC/MS/MS möjliggör noggrann kvantifiering av alla tre steroider i en enda analys med 100 % tillförlitlighet.
• Rutinmässig screening av nyfödda med immunanalyser är annorlunda hög nivå pubic-positiva och falsk-negativa resultat. HPLC/MS/MS-bestämningen av inte bara kortisol utan även aldosteron och 11-deoxikortisol gör det möjligt att skilja mellan primär och sekundär binjurebarkinsufficiens.
• HPLC/MS/MS möjliggör bestämning av steroider vid prostatit och kroniskt bäckensmärtasyndrom.
• HPLC-MS/MS låter dig bestämma steroidprofilen och identifiera orsakerna till tidig pubertet i samband med binjurebarken hos små barn. Det visade sig att koncentrationerna av testosteron, androstenedion, dehydroepiandrosteron (DHEA) och dess sulfat hos dessa barn var något högre än hos äldre kontrollbarn.
• Serum från aktiva rökare, passiva rökare och icke-rökare analyseras för förekomst av 15 steroidhormoner och sköldkörtelhormoner för att undersöka sambandet mellan rökexponerade patienter och hormonkoncentrationer.
• HPLC/MS/MS används vid profilering av vissa kvinnliga steroidhormoner i urin.
• Med hjälp av HPLC/MS/MS utvärderades koncentrationerna av neuroaktiva hormoner för att förhindra diabetisk neuropati.

II. Bestämning av sköldkörtelhormoner

Rutinmässiga metoder för att bestämma sköldkörtelhormoner är vanligtvis baserade på radioimmunoanalys, som är dyr och endast upptäcker T3 och T4, vilket kan begränsa möjligheten att bestämma och helt reglera sköldkörtelfunktionen.

• För närvarande, med hjälp av HPLC-MSMS, utförs samtidig analys av fem sköldkörtelhormoner i blodserumprover, inklusive tyroxin (T4), 3,3',5-trijodtyronin (T3), 3,3',5'- (rT3) 3,3'-dijodtyronin (3,3'-T2) och 3,5-dijodtyronin (3,5-T2) i koncentrationsområdet 1-500 ng/ml.
• HPLC/MS/MS-metoden används också för att analysera hormonernas sammansättning hos patienter som genomgått tyreoidektomi. Nivåerna av tyroxin (T4), trijodtyronin (T3), fritt T4 och sköldkörtelstimulerande hormon (TSH) efter operationen bestäms. HPLC/MS/MS har visat sig vara ett utmärkt sätt att fastställa sambandet mellan TSH och sköldkörtelhormonkoncentrationer.
• HPLC/MS/MS-metoden användes för att bestämma tyroxin (T4) i saliv och humant blodserum. Metoden kännetecknas av hög reproducerbarhet, noggrannhet och en detektionsgräns på 25 pg/ml. Studier har visat att det finns ett diagnostiskt samband i saliv-T4-koncentrationer mellan eutyroid-patienter och patienter med Graves sjukdom.

HPLC/MS/MS-metoden har nu den känslighet, specificitet och noggrannhet som krävs för att på ett tillförlitligt sätt detektera alla steroider i biologiska vätskor och ökar därmed den diagnostiska förmågan, särskilt när det gäller steroider.

III. Bestämning av 25-hydroxivitamin D med HPLC/MS/MS

25-hydroxi-vitamin D (25OD) är den huvudsakliga cirkulerande formen av vitamin D och prekursorn till dess aktiva form. (1,25-dioxivitamin D). På grund av dess långa halveringstid är bestämningen av 25OD viktig för att bestämma statusen för D-vitamin i patientens kropp. Vitamin D finns i två former: vitamin D3 (kolekalciferol) och vitamin D2 (ergokalciferol). Båda formerna metaboliseras till sina respektive 25OD-former. Av stor betydelse för diagnosen är tillgången på analysmetoder som kan bestämma båda formerna av vitaminet med hög noggrannhet och möjliggöra övervakning av patienter med sjukdomar i vitamin D. De metoder som hittills använts har inte möjliggjort separat bestämning av vitamin D2 och D3. Vid höga koncentrationer av vitamin D2 underskattas dessutom den detekterbara mängden D3. En annan nackdel är användningen av radioaktiva isotoper. Användningen av HPLC/MS/MS-metoden gjorde det möjligt att inte bara undvika användningen av radioaktiva isotoper, utan också att genomföra en separat bestämning av båda aktiva formerna av vitaminet.

Metoden är användbar för följande patienter:
1. Om du misstänker ett lågt innehåll av D-vitamin i kroppen;
2. Om en oförklarlig toxisk effekt misstänks;
3. Vid undersökning av patienter som genomgår behandling för lågt innehåll av D-vitamin;
4. Användningen av HPLC/MS/MS möjliggjorde separat bestämning av båda formerna under patientövervakning.

IV. Bestämning av immunsuppressiva medel med HPLC/MS/MS

Efter en organtransplantation måste immunsuppressiva medel tas hela livet för att undvika avstötning. Med ett mycket smalt terapeutiskt fönster och hög toxicitet kräver immunsuppressiva individuella doser för att uppnå maximal effekt. Därför är det viktigt att övervaka de viktigaste immunsuppressiva medlen: ciklosporin A, takrolimus, sirolimus och everolimus för att justera läkemedelsdosen för varje enskild patient beroende på koncentrationen av läkemedlet i blodet.

Immunanalyser används fortfarande för att övervaka dessa läkemedel, men dessa metoder är dyra och deras specificitet, noggrannhet och reproducerbarhet är begränsad. Patienter har dött av felaktig dosering av immunsuppressiva läkemedel baserat på resultat som erhållits med immunologiska metoder. För närvarande ersätts immunanalyser i kliniska laboratorier med HPLC/MS/MS. Till exempel, på kliniken vid universitetet i München, analyseras cirka 70 prover dagligen för innehållet av sirolimus och ciklosporin A med hjälp av ett HPLC/MS/MS-system. All provberedning och instrumentkontroll utförs av en person. Laboratoriet går också över till analys av takrolimus med denna metod.

• Användningen av HPLC/MS/MS för rutinmässig samtidig bestämning av takrolimus, sirolimus, askomycin, demetoxisirolimus, cyklosporin A och cyklosporin G i blod beskrivs. Området som bestäms av koncentrationen är 1,0 - 80,0 ng / ml. För ciklosporin 25 - 2000 ng / ml. Över 50 000 prover analyserades i laboratoriet under året.
• Eftersom det visade sig att samtidig användning av takrolimus och sirolimus ger en positiv terapeutisk effekt, utvecklades en enkel och effektiv HPLC/MS/MS-metod för att separat bestämma dem i blod för kliniska analyser. Analysen av ett prov tar 2,5 minuter med en noggrannhet på 2,46 % - 7,04 % för takrolimus och 5,22 % - 8,30 % för sirolimus för hela analyskurvan. Den nedre gränsen för detektion av takrolimus är 0,52 ng/ml, sirolimus är 0,47 ng/ml.

V. Bestämning av homocystein med HPLC/MS/MS

Homocystein är av intresse vid hjärt-kärlsjukdomar (tromboembolism, hjärtsjukdomar, åderförkalkning) och andra kliniska tillstånd (depression, Alzheimers sjukdom, osteoporos, graviditetskomplikationer, etc.). Befintliga metoder för analys av homocystein, inklusive immunanalys, är dyra. En snabb HPLC/MS/MS-metod för analys av homocystein har utvecklats för rutinmässig klinisk användning vid analys av ett stort antal prover. Jonisering utfördes genom elektrospraymetoden. Metoden är reproducerbar, mycket specifik och exakt. Fördelarna med metoden är också den låga kostnaden för reagenser och enkelheten i provberedningen. Det är möjligt att analysera 500 eller fler prover per dag.

Slutsats

Det bör noteras att även om avsevärt förbättrade immunanalysmetoder för närvarande används, på grund av tekniska grundläggande begränsningar, kommer denna metod aldrig att ha jämförbar noggrannhet och specificitet till målsubstansen jämfört med HPLC-MSMS, särskilt i närvaro av metaboliter. Detta leder inte bara till låg noggrannhet av ELISA-metoden och en hög andel falskt positiva och falskt negativa resultat, utan tillåter inte heller jämförelse av resultaten som erhållits på olika kliniska avdelningar med hjälp av ELISA-metoden. Användningen av HPLC-MS/MS eliminerar denna nackdel, vilket möjliggör mycket specifik, noggrann och snabb analys av ett stort antal prover med hög tillförlitlighet i närvaro av metaboliter och frånvaro av interferens från samtidiga och endogena substanser i plasma och blod av patienter.

Trots den uppenbara höga kostnaden för instrumentkomplexet, som världens praxis visar, med korrekt drift, lönar sig detta komplex på 1-2 år. Detta beror främst på den låga kostnaden för en analys på grund av den samtidiga analysen av tiotals och hundratals föreningar och frånvaron av behovet av att köpa dyra diagnostiska kit. Dessutom har laboratoriet möjlighet att självständigt utveckla alla nödvändiga analysmetoder och inte vara beroende av tillverkaren av kiten.

Att välja rätt instrumentkonfiguration

Det finns ett stort antal olika metoder för masspektrometri och typer av masspektrometrar utformade för att lösa en mängd olika problem - från strukturell identifiering av komplexa proteinmakromolekyler som väger hundratusentals Dalton till rutinmässig kvantitativ analys med hög genomströmning av små molekyler.

För att framgångsrikt lösa uppgiften är ett av huvudvillkoren valet av rätt typ av utrustning. Det finns inget universellt instrument som kan lösa hela skalan av analytiska problem. Således är en anordning utformad för att lösa problemet med att identifiera mikroorganismer inte kapabel att utföra en kvantitativ analys av små molekyler. Och vice versa. Faktum är att, trots det vanliga namnet, dessa är helt olika enheter som fungerar på olika fysiska principer. I det första fallet är detta en time-of-flight masspektrometer med en laserjoniseringskälla - MALDI-TOF, och i det andra fallet - en trippel kvadrupol med elektrosprayjonisering - HPLC-MSMS.

Den näst viktigaste parametern är valet av korrekt systemkonfiguration. Det finns flera stora tillverkare av masspektrometrisk utrustning. Enheterna från varje tillverkare har inte bara sina styrkor, utan också svagheter, som de vanligtvis föredrar att vara tysta om. Varje tillverkare tillverkar sin egen linje av enheter. Kostnaden för ett analytiskt komplex ligger i intervallet 100 000 USD till 1 000 000 USD eller mer. Att välja den bästa tillverkaren och rätt utrustningskonfiguration kommer inte bara att spara betydande ekonomiska resurser, utan också lösa problemet mer effektivt. Tyvärr finns det många exempel där laboratoriets utrustning utförts utan att ta hänsyn till dessa faktorer. Resultatet är ledig utrustning, bortkastade pengar.

Den tredje faktorn som avgör laboratoriets framgångsrika drift är personalen. Masspektrometrar kräver högt kvalificerad personal. Tyvärr har inget av universiteten i Ryssland en kurs i modern praktisk masspektrometri, särskilt i relation till kliniska tillämpningar, och uppgifterna att utbilda personalen på varje laboratorium måste lösas på egen hand. Naturligtvis är 2-3 dagars introduktionsutbildning utförd av tillverkaren efter lanseringen av utrustningen absolut inte tillräckligt för att förstå grunderna i metoden och skaffa färdigheter i att arbeta med enheten.

Den fjärde faktorn är bristen på färdiga analysmetoder. Varje laboratorium har sitt eget prioriterade uppgifter, för vars lösning det är nödvändigt att utveckla sina egna metoder. Detta kan göras av en person som har erfarenhet av att arbeta på enheten i minst 2-3 år. Tillverkare tillhandahåller ibland en eller två generella metoder av rekommendationskaraktär, men anpassar dem inte till specifika laboratorieuppgifter.

V BioPharmExpert LLC Här arbetar specialister med mångårig erfarenhet av att arbeta med olika typer av masspektrometrar, samt utveckling av metoder och formulering av högpresterande analyser. Därför tillhandahåller vi följande tjänster:

1. Val av optimal instrumentkonfiguration för specifika kunduppgifter.
2. Inköp, leverans och lansering av utrustning från ledande tillverkare av tandemmasspektrometrar Stegvis utbildning av personal inom ett år från lanseringsdatumet.
3. En uppsättning färdiga metoder och databaser för att lösa grundläggande kliniska problem.
4. Utveckling av metoder för analys och lösning av specifika uppgifter för klienten i hans laboratorium med involvering av hans personal.
5. Metodstöd i alla skeden av arbetet.

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är en kolonnkromatografimetod där den mobila fasen (MP) är en vätska som rör sig genom en kromatografisk kolonn fylld med en stationär fas (sorbent). HPLC-kolonner kännetecknas av högt hydrauliskt tryck vid kolonnens inlopp, varför HPLC ibland kallas "Högtrycksvätskekromatografi".

Beroende på mekanismen för separation av ämnen särskiljs följande varianter av HPLC: adsorption, distribution, jonbyte, uteslutning, kiral, etc.

Vid adsorptionskromatografi sker separationen av ämnen på grund av deras olika förmåga att adsorberas och desorberas från ytan av en adsorbent med utvecklad yta, till exempel silikagel.

Vid partitions-HPLC sker separation på grund av skillnaden i fördelningskoefficienterna för de ämnen som ska separeras mellan de stationära (som regel kemiskt ympade på ytan av ett stationärt underlag) och mobila faser.

Genom polaritet delas PF och NF HPLC in i normalfas och omvänd fas.

Normalfaskromatografi är en variant av kromatografi som använder en polär sorbent (till exempel kiselgel eller kiselgel med ympade NH 2 - eller CN-grupper) och opolär PF (till exempel hexan med olika tillsatser). I omvänd faskromatografi används opolära kemiskt modifierade sorbenter (t.ex. opolära C18-alkylradikal) och polära mobila faser (t.ex. metanol, acetonitril).

Vid jonbyteskromatografi separeras molekylerna av ämnena i blandningen, dissocierade i lösning till katjoner och anjoner, när de rör sig genom sorbenten (katjonbytaren eller anjonbytaren) på grund av deras olika utbyteshastigheter med jongrupperna i sorbenten .

Vid storleksuteslutning (sil, gelpenetrerande, gelfiltrering) kromatografi separeras molekylerna av ämnen efter storlek på grund av deras olika förmåga att penetrera in i den stationära fasens porer. I det här fallet är de största molekylerna (med den högsta molekylvikten) som kan tränga in i det minsta antalet porer i den stationära fasen de första som lämnar kolonnen, och ämnena med små molekylstorlekar är de sista som lämnar.

ofta sker separationen inte av en, utan av flera mekanismer samtidigt.

HPLC-metoden kan användas för kvalitetskontroll av alla icke-gasformiga analyter. För analys används lämpliga instrument - vätskekromatografer.

Sammansättningen av en vätskekromatograf inkluderar vanligtvis följande huvudkomponenter:

– En PF-beredningsenhet, inklusive en tank med en mobil fas (eller tankar med individuella lösningsmedel som ingår i den mobila fasen) och ett PF-avgasningssystem.

– pumpsystem;

– mobil fasblandare (vid behov);

– provinsprutningssystem (injektor);

– kromatografisk kolonn (kan installeras i en termostat);

– detektor;

– System för datainsamling och bearbetning.

Pumpsystem

Pumparna tillför PF till kolonnen med en given konstant hastighet. Sammansättningen av den mobila fasen kan vara konstant eller förändras under analysen. I det första fallet kallas processen isokratisk, och i det andra - gradient. Filter med en pordiameter på 0,45 µm installeras ibland före pumpsystemet för att filtrera den mobila fasen. Ett modernt vätskekromatografpumpsystem består av en eller flera datorstyrda pumpar. Detta gör att du kan ändra sammansättningen av PF enligt ett specifikt program under gradienteluering. Blandningen av PF-komponenter i blandaren kan ske både vid lågt tryck (före pumpar) och vid högt tryck (efter pumpar). Blandaren kan användas för framställning av PF och för isokratisk eluering, men ett mer exakt förhållande mellan komponenter uppnås genom att förblandning av PF-komponenterna för den isokratiska processen. Analytiska HPLC-pumpar gör det möjligt att upprätthålla ett konstant flöde av PF in i kolonnen i intervallet från 0,1 till 10 ml/min vid ett kolonninloppstryck på upp till 50 MPa. Det är dock tillrådligt att detta värde inte överstiger 20 MPa. Tryckpulseringar minimeras genom speciella spjällsystem som ingår i pumparnas design. Pumparnas arbetsdelar är gjorda av korrosionsbeständiga material, vilket möjliggör användning av aggressiva komponenter i PF:s sammansättning.

1

En validerad HPLC-MS/MS-metod utvecklades för att identifiera och kvantifiera det nya aminosyraderivatet av 1,3,4-tiadiazol LHT7-09. Den maximala känsligheten för LHT7-09 masspektrometrisk detektering uppnåddes i det positiva jondetektionsläget vid en elektrosprayspänning på 5500 V och en deklusterpotential på 36 V. De identifierade MRM-övergångarna bekräftade den kemiska strukturen hos det nya aminosyraderivatet av 1, 3,4-tiadiazol. För att effektivt isolera LHT7-09 från multikomponentblandningar av tiadiazolylamider utvecklades ett gradientsätt för högpresterande vätskekromatografi med en blandning av acetonitril och avjoniserat vatten i olika förhållanden som elueringsmedel. För dessa kromatografiska betingelser bestämdes retentionstiden för föreningen LHT7-09 till 11 minuter. För den kvantitativa bestämningen av föreningen LHT7-09 utvecklades en kalibreringslösning för beroendet av området för den kromatografiska toppen på lösningens koncentration.

whr-ms/ms

kromatografi

masspektrometri

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Studie av den antiinflammatoriska aktiviteten av nya tiadiazolderivat vid formalintassödem hos råttor / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // Samtida frågor vetenskap och utbildning. - 2013. - Nr 3. www..

2. Nya tiadiazolderivat med svampdödande aktivitet / A.S. Koshevenko [et al.] // Framsteg inom medicinsk mykologi. - 2015. - T. 14. - S. 348-351.

3. Syntes och antitumöraktivitet av nya furyl-2-substituerade 1,3,4-tiadiazoler, 1,2,4-triazoler / T.R. Ovsepyan [et al.] // Chemical Pharmaceutical Journal. - 2011. - T. 45. - Nr 12. - P. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Utvärdering av den akuta toxiciteten av ett nytt aminosyraderivat av tiadiazol när det administreras intraperitonealt till möss/N.S. Popov, M.A. Demidov // Upper Volga Medical Journal. - 2016. - V. 15, nr. 1. - S. 9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Utvärdering av ulcerogeniciteten hos ett nytt aminosyraderivat av tiadiazol när det administreras intragastriskt till råttor / N.S. Popov, M.A. Demidova // Doktorand. - 2017. - Nr 1 (80). - S. 71-78.

6. Syntes och antimikrobiell aktivitet av fenyltio- och bensylsulfonylättiksyraamider baserade på 2-amino-5-alkyl(arylalkyl)-1,3,4-tiadiazoler / S.A. Serkov [et al.] // Chemical Pharmaceutical Journal. - 2014. - T. 48, nr 1. - S. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Syntes och farmakologisk aktivitet av imidazothiadiazolderivat // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Vol. 73. Nej. 4. s. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Synthesis and Anticancer Activity of New 1-Thia-4-azaspirodecane, their Derived Thiazolopyrimidine and 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molecules. 2017. Nej. 22(1). S. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Salter av 5-amino-2-sulfonamid-1,3,4-tiadiazol, en strukturell och analog av acetazolamid, visar intressanta kolsyraanhydrashämmande egenskaper, diuretisk och antikonvulsiv verkan // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Vol. 12. Nej. 6. s. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Syntes och antifungal aktivitet av dehydroabietinsyrabaserade 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinonföreningar // Molekylär mångfald. 2016. Vol. 20. Nej. 4. s. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Syntes, biologisk utvärdering och molekylär modelleringsstudie av nya (1,2,4-triazol eller 1,3,4-tiadiazol)-metyltio-derivat av kinazolin-4(3H)-on som DHFR-hämmare // Bioorganisk kemi. 2017 Vol. 72. s. 282-292.

Högpresterande vätskekromatografi med masspektrometrisk detektion är en av de mest lovande metoderna för identifiering och kvantifiering av läkemedel i olika biologiska föremål. Metoden kännetecknas av hög specificitet, noggrannhet och förmåga att bestämma ämnen i minimala koncentrationer, vilket gör att den kan användas för kvantitativ bestämning av läkemedel i farmakokinetiska studier och läkemedelsövervakning, vilket är signifikant för klinisk laboratoriediagnostik. För detta ändamål är det nödvändigt att utveckla och validera metoder för kvantitativ bestämning av olika läkemedelssubstanser, inklusive innovativa, baserade på HPLC-MS/MS-metoden.

Det ursprungliga läkemedlet från gruppen icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel är acexazolamid, ett nytt derivat av 1,3,4-tiadiazolamid och acexamsyra. En betydande fördel med denna förening är dess låga toxicitet och låga ulcerogenicitet. För att utföra farmakokinetiska studier och bedöma biotillgängligheten av denna läkemedelssubstans med olika administreringsvägar är det nödvändigt att utveckla en tillförlitlig metod för dess kvantitativa bestämning i biologiska vätskor.

Syftet med denna studie var utvecklingen av en metodik för identifiering och kvantifiering av ett nytt icke-steroid antiinflammatoriskt läkemedel från gruppen av tiadiazolderivat med hjälp av HPLC-MS/MS.

Material och metoder

Syftet med studien var ett nytt tiadiazolderivat med laboratoriekod LHT 7-09, syntetiserat vid JSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) prof. S.Ya. Skachilova (Fig. 1).

2-(5-etyl-1,3,4-tiadiazolyl)amid av 2-acetylaminohexansyra

Ris. 1. Kemisk struktur för LHT 7-09 (bruttoformel: C 12 H 20N 4 Ungefär 2S; molmassa 284,4g/mol)

Förening LHT 7-09 utseendeär ett vitt pulver, som är praktiskt taget olösligt i vatten, lösligt i alkohol, fritt lösligt i acetonitril.

En validerad högpresterande vätskekromatografi med masspektrometrisk detektion (HPLC-MS/MS) metod användes för att identifiera och kvantifiera LCT 7-09.

Kromatografi utfördes med användning av en Agilent 1260 Infinity II högpresterande vätskekromatograf (Agilent Technologies, Tyskland). En Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm analytisk kolonn användes i studien. För att isolera föreningen som studeras utvecklade vi ett gradientkromatografiläge. Acetonitril, avjoniserat vatten och ammoniumacetat användes som elueringsmedel i olika proportioner.

Masspektrometri utfördes på en ABSciexQTrap 3200 MD trippelkvadrupolmasspektrometer (ABSciex, Singapore) med en elektrosprayjonkälla (TurboV med TurboIonSpray-sond). Masspektrometern kalibrerades med användning av en testlösning av reserpin vid en koncentration av 6,1 x 10-2 mg/l.

Masspektrometrisk analys av de studerade proverna utfördes i elektrospray-mod med direkt injektion av provet och eluatet tillfört av kromatografen. Direkt injektion av testproverna i masskromatografen utfördes med en sprutpump med en diameter på 4,61 mm med en hastighet av 10 μl/min.

När man utvecklade en teknik för identifiering och kvantitativ bestämning av ett nytt tiadiazolderivat valdes de optimala förhållandena för högpresterande vätskekromatografi och massdetektion. Ämnets utträdestid från den kromatografiska kolonnen och MRM-övergången togs i beaktande (registrering utfördes m/z prekursorjon på den första analytiska kvadrupolen Q1 och m/z produktjoner på den andra analytiska kvadrupolen Q3). För den kvantitativa bestämningen av LHT 7-09 konstruerades en kalibreringskurva i koncentrationsintervallet från 0,397 till 397 ng/ml.

AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex) användes som programvara.

resultat och diskussion

I det första skedet pilot studie massdetektion av testprovet utfördes genom direkt injektion i massdetektorn med användning av en sprutpump. Vid provberedningsstadiet erhölls en lösning av LHT 7-09 (500 ng/ml) i en blandning av acetonitril och joniserat vatten i ett förhållande av 2:1 med tillsats av ammoniumacetat (0,1%).

Preliminära experiment visade att i det positiva jondetektionsläget var känsligheten för LCT 7-09-detektion högre, och masspektrumet var mer intensivt och informativt än i det negativa jondetektionsläget. I detta avseende användes i ytterligare studier endast det positiva joniseringsläget.

För att erhålla en intensiv topp valdes följande massdetektionsförhållanden: : positiv polarisation, elektrosprayspänning på 5500,0 V, deklusteringspotential och ingångspotential på 36,0 respektive 6,5 V, vid ett gardingastryck på 20,0 psi och en spraygas på 40,0 psi, en hastighet på 10 µl/min. Skanningsområdet var 270-300 Da.

Analys av det erhållna masspektrumet i den första analytiska kvadrupolen Q1 visade att under dessa förhållanden, på grund av tillsatsen av en väteproton, bildas en protonerad molekyl av den studerade föreningen + med värdet m/ z 285,2 Ja (Fig. 2).

Ris. 2. Masspektrum för den protonerade LHT 7-09-molekylen (i positiv jonskanningsläge +)

På den andra analytiska kvadrupolen Q3 registrerades produktjoner för prekursorjonen med värdet m/z 285,2 Ja. Analys av masspektrumet av andra ordningen visade närvaron av många toppar, varav 3 var de mest intensiva - m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da och m/z 75,1 Da (fig. 3).

Ris. 3. Masspektrum av produktjoner (i positiv jonskanningsläge, prekursorjonm/ z285,2 Ja)

För att erhålla en högintensiv jonsignal valdes de optimala energivärdena i Q2-kollisionscellen (energiområdet från 0 till 400 V beaktades). För produktjoner med värden m/ z 114,2 Da, 130,2 Da och 75,1 Da, den optimala energin i anslagscellen var 27 V respektive; 23 V och 49 V.

Det antas att produkten jon med värdet m/ z 114,2 Da är ett fragment av 5-amino-2-etyl-1,3,4-tiadiazol, eftersom fragmenteringen av andra 1,3,4-tiadiazolderivat också avslöjar en produktjon med samma värde m/ z. Jonprodukt med värde m/ z 130,2 Da är förmodligen ett protonerat fragment av acexaminsyra. Således bekräftade resultaten av massdetekteringen av det studerade provet den kemiska strukturen hos det nya 1,3,4-tiadiazolderivatet.

Vid nästa steg av den experimentella studien analyserades den analyserade föreningen med HPLC-masspektrometri.

I HPLC-MS/MS-läget användes följande joniseringsförhållanden: elektrosprayspänning 5500,0 V, mobilfasflöde 400 μl/min, kvävetemperatur 400 °C, gardingas- och sprayflödestryck 20,0 respektive 50,0 psi. Registreringshastigheten för enstaka masspektra var 100 spektra per sekund. För att erhålla ett sammanfattat masspektrum på kromatogrammet tilldelades ett tidsintervall på 10,5-11,5 minuter; enligt intensiteten av signalen för produktjoner, plottades kurvorna för tidsberoendet för jonströmmen och arean av topparna för individuella signaler som motsvarar testföreningen. Volymen av provet som injicerades i den analytiska kolonnen var 10 ul.

För att isolera den studerade föreningen användes ett gradientsätt för högpresterande vätskekromatografi, vilket tillhandahölls genom att ändra sammansättningen av eluenten vid ingången till den analytiska kolonnen. Acetonitril, avjoniserat vatten och ammoniumacetat användes som elueringsmedel i olika proportioner. Valet av gradientläge för kromatografi berodde på det faktum att det under förhållandena för det isokratiska elueringssättet (inklusive användningen av olika koncentrationer av acetonitril) inte var möjligt att erhålla en topp av testsubstansen med en symmetrisk form med en retentionstid som är lämplig för analys. Enligt studien var följande eluenttillförselläge optimalt: från 0 till 4 minuter var koncentrationen av acetonitril 1 %; från 4 till 8 minuter linjär ökning av koncentrationen av acetonitril upp till 99%; från 8 till 12 minuter - isokratisk sektion (1% acetonitril). Efter avslutad studie tvättades den kromatografiska kolonnen med 30 % acetonitrillösning under 5 minuter.

Vid användning av det beskrivna kromatografisättet för den studerade föreningen erhölls en symmetrisk topp med tillräcklig intensitet (fig. 4).

Ris. 4. Kromatogram LHT 7-09 (analytisk kolonnAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1x10 mm; gradientlägeskromatografi)

Analys av de erhållna kromatogrammen för LHT 7-09-lösningar av olika koncentrationer visade att retentionstiden (tR) under dessa elueringsbetingelser var 11 minuter och inte berodde på koncentrationen av testsubstansen. I detta avseende kan värdet på retentionstiden användas som ett ytterligare kriterium för att bekräfta äktheten av LHT 7-09 i flerkomponentblandningar. Det är anmärkningsvärt att dessa kromatografiparametrar kan användas för att identifiera LHT 7-09 inte bara med en massdetektor utan även med andra detektorer, inklusive en fotometrisk.

För den kvantitativa bestämningen av det nya tiadiazolderivatet konstruerades en kalibreringskurva i koncentrationsintervallet från 0,397 ng/ml till 397 ng/ml (fig. 5).

Ris. Fig. 5. Kalibreringsdiagram för att bestämma koncentrationen av LHT 7-09 (längs abskissaxeln - koncentrationen av LHT 7-09 i ng / ml, längs ordinataaxeln - topparean i pulser)

För att utveckla en kalibreringslösning användes LHT 7-09-lösningar i koncentrationer av 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Toppareans beroende av koncentrationen av den studerade föreningen beskrevs med följande regressionsekvation:

y= 8,9e 5 x 0,499, värdet på regressionskoefficienten var r=0,9936.

Det bör noteras att den utvecklade kalibreringslösningen gör det möjligt att utföra den kvantitativa bestämningen av den studerade föreningen med hög noggrannhet i ett brett spektrum av koncentrationer, vilket gör det möjligt att använda denna metod för att bedöma kvaliteten på den medicinska substansen och för att genomföra farmakokinetiska studier.

Resultatet av studien var således utvecklingen av en metod för identifiering och kvantitativ bestämning av ett nytt aminosyraderivat av tiadiazol med hjälp av HPLC-MS/MS.

Slutsatser

1. HPLC-MS/MS möjliggör identifiering och kvantifiering av ett nytt aminosyraderivat av tiadiazol med hög noggrannhet.
2. Massdetektering av ett nytt tiadiazolderivat LHT 7-09 utförs lämpligen i positiv jonskanning (MRM-övergång - prekursorjon Q1 m/ z 285,2 Ja; produktjoner Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da och m/ z 75,1 Da).
3. För att isolera LCT 7-09 från multikomponentblandningar utvecklades en högpresterande vätskekromatografiteknik (analytisk kolonn Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 × 10 mm; elueringsmedel acetonitril: avjoniserat vatten: ammoniumacetat; gradientläge).

Bibliografisk länk

Popov N.S., Malygin A.S., Demidova M.A. UTVECKLING AV HPLC-MS/MS-METOD FÖR IDENTIFIERING OCH KVANTITATIV BESTÄMNING AV ETT NYTT TIADIAZOLDERIVAT // Moderna problem inom vetenskap och utbildning. - 2017. - Nr 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26988 (åtkomstdatum: 01.02.2020). Vi uppmärksammar er tidskrifter som publicerats av förlaget "Academy of Natural History"